Direct Inductie van Hemogenic Endotheel en Bloed door overexpressie van transcriptiefactoren in menselijke pluripotente stamcellen

Het unieke vermogen van humane pluripotente stamcellen (hPSCs) om te hernieuwen en te differentiëren tot cellen van de drie kiembladen, met inbegrip van bloed, maken ze een waardevol instrument voor de mechanistische studies van hematopoietische ontwikkeling modellering van bloedziekten, drug screening, toxiciteit studies, en de ontwikkeling van cellulaire therapieën. Omdat de vorming van bloed in het embryo opbrengsten van hemogenic endotheel (HE) door een endotheliale hematopoietische overgang ^1,2, de opwekking van HE in culturen zou essentieel om de moleculaire mechanismen reguleren van de endotheelcellen aan hematopoietische overgang en hematopoietische specificatie te bestuderen. Huidige werkwijzen voor het onderzoeken van HE zijn gebaseerd op de inductie van differentiatie in hematoendothelial aggregaten (EBS) met toevoeging van hematopoïetische cytokinen ^5/3 en co-kweek van hPSCs met hematopoiese-ondersteunende stromale cellen ^6,7 of tweedimensionale kweken met extracellulaire matrices en cytokines ^8,9. Deze klassieke differentiatie methoden zijn gebaseerd op de introductie van externe signalen handelen op het celoppervlak en het initiëren van cascades van moleculaire mechanismen die uiteindelijk leiden tot de activering van transcriptie programma begeleiden hematoendothelial ontwikkeling. Derhalve de efficiëntie van hPSCs differentiaties in deze systemen is gebaseerd op een effectieve inductie van die signalen, signaaltransductie naar de kern en de resulterende activatie van specifieke transcriptiefactoren. Daarnaast is de studie van HE gebruikelijke differentiatie culturen vereist de extra stap van het isoleren van cellen met behulp HE celsortering. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor rechtstreekse inductie van HE en bloed door overexpressie van hematopoietische transcriptiefactoren. Deze werkwijze maakt een efficiënte inductie van HE in een schotel en directe observatie van de endotheliale hematopoietische overgang zonder de noodzaak van isolatie van HE via een omslachtige procedure celsortering.

Vorming van HE en bloed van humane pluripotente stamcellen efficiënt worden geïnduceerd door overexpressie enkele transcriptiefactoren (TF). De optimale combinatie van TFs kan induceren robuuste pan-myeloïde hematopoiese van hPSCs omvat ETV2 en GATA1 of GATA2. In tegenstelling, een combinatie van GATA2 en Tal1 induceert erythromegakaryocytopoiesis ^10. Programmering hPSCs door de overexpressie van deze factoren onderscheidt hPSCs direct naar VE-cad ⁺ CD43 ^– CD73 ^– HE cellen die geleidelijk verwerven van de hematopoietische fenotype bepaald door de expressie van de vroege hematopoietische marker CD43 ^7. Deze lentivirale methode voor de rechtstreekse programmering van humane pluripotente stamcellen methode is toepasbaar voor het genereren van HE en bloedcellen voor mechanistische studies, studies van endotheliale hematopoietische overgang en transcriptieregulatie van hematopoietische ontwikkeling en specificatie. Hoewel de cUIDIGE protocol beschrijft bloedproductie via constitutieve expressie van de transgenen, soortgelijke resultaten kunnen worden verkregen met gewijzigde mRNA ^10.