La aplicación de un sistema de expresión inducible para el Estudio de la interferencia de los factores de virulencia bacteriana con Señalización Intracelular

La virulencia de muchos patógenos Gram-negativas bacterias depende de sistemas de secreción especializados para secuestrar células huésped eucariotas. Las bacterias utilizan estos sistemas de secreción para inyectar proteínas de virulencia bacteriana (efectores) en la célula huésped para modular una variedad de actividades celulares y bioquímicos. El estudio de las proteínas efectoras no sólo ha proporcionado notable penetración en los aspectos fundamentales de huésped / patógeno, sino también en la biología básica de las células eucariotas ^1. La modulación de la apoptosis de las células huésped ha sido demostrado ser un mecanismo de virulencia importante para muchos patógenos intracelulares, y una serie de proteínas efectoras que modulan la apoptosis se han identificado ^2-9. Sin embargo, sus mecanismos moleculares precisos de actividad sigue siendo difícil en muchos casos.

Apoptosis, una forma de muerte celular programada, juega un papel importante en la respuesta inmune a la infección ^10. Dos vías principales que conducen a la apoptosis tienenhan identificado: la orientación de la mitocondria (apoptosis intrínseca) o transducción directa de la señal a través de receptores de muerte celular en la membrana plasmática (apoptosis extrínseca). La vía de la muerte celular intrínseca o mediada por mitocondrias se activa por señales intracelulares e implica la activación de Bax y Bak, dos miembros pro-apoptóticos de la familia Bcl-2. Esta familia se compone de proteínas reguladoras pro-y anti-apoptóticos que controlan la muerte celular ^11-14. La activación de la apoptosis conduce a la oligomerización de Bax y Bak seguidos por subsiguiente permeabilización de la membrana externa mitocondrial, lo que resulta en la liberación del citocromo C en el citoplasma. La liberación del citocromo C inicia la activación de las caspasas efectoras 3 y 7 a través de la activación de la caspasa 9 en el apoptosome ^15. Esto conduce a la proteolisis de sustratos seleccionados que, entre otros, los resultados en la exposición de fosfatidilserina en la superficie celular ¹⁶ y libera una DNasa dedicado que fragmenta chromatin ^17,18.

Con el fin de determinar dónde dentro de la cascada apoptótica una proteína efectora individuo interfiere, un sistema de expresión inducible se empleó ^19. Los sistemas de regulación para la expresión condicional de transgenes han sido una herramienta muy valiosa en el análisis de la función de una proteína dentro de la célula o su importancia para el tejido, órgano y desarrollo del organismo, así como durante la iniciación, progresión y mantenimiento de la enfermedad ^20-23. Típicamente, los sistemas de control inducibles, tales como el sistema Tet ²⁴ empleado aquí, forman una unidad de transcripción artificial (véase la Figura 1). Uno de los componentes es un factor de transcripción diseñados artificialmente llamada tTA (activador de la transcripción dependiente de tetraciclina), formado por la fusión del represor de la transcripción bacteriana TetR ²⁵ a un dominio de proteína de mamífero que media la activación transcripcional o silenciar ^24,26. El segundo componente es un híbridopromotor, denominado TRE (elemento sensible a la tetraciclina), que consiste en un promotor mínimo eucariota, que contiene al menos una caja TATA y un sitio de iniciación de la transcripción, unido a múltiples repeticiones del sitio de unión al ADN cognado para TetR, tetO ^24,25. El tercer componente es el ligando natural de TetR, tetraciclina o uno de sus derivados, tales como anhidrotetraciclina o doxiciclina ^25. Después de la adición de ligando al medio de cultivo, TetR pierde su afinidad por tetO y se disocia de la TRE. Como resultado, la transcripción del gen diana es abolida. La expresión del transgen puede, por lo tanto, ser estrechamente controlada de una manera tiempo y dependiente de la dosis, tanto en cultivos celulares y en animales ^20,23,24. Con tTA, la expresión del transgen se produce constitutivamente, excepto en la presencia de una tetraciclina. Esto puede ser una desventaja en el estudio de proteínas citotóxicas o oncogénicos porque tetraciclina tiene primero que ser eliminado del sistema, antes de expressio transgénn se produce y los efectos de la proteína diana en la célula puede ser monitoreado. Esto puede llevar mucho tiempo y no siempre es completa, especialmente en animales transgénicos ^27. Para abordar esta limitación, se usó un mutante TetR con una respuesta inversa a la presencia de doxiciclina para generar un nuevo factor de transcripción, rtTA (inversa tTA) ^28. Sólo se une a la TRE y, concomitantemente, activa la transcripción en presencia de doxiciclina. Leakiness residual del sistema, es decir., La expresión del transgen en ausencia de factor de transcripción unido a la TRE, originando ya sea (i) a partir de los efectos de posición en un sitio de integración genómica, (ii) de la propia TRE ^29, o (iii) de la no específico de unión de tTA / rtTA ^28, fue abordado mediante la introducción de un silenciador transcripcional adicional, denominado TTS (silenciador transcripcional dependiente de tetraciclina) ³⁰ al sistema. Se forma una red regulador dual junto con rtTA (véase la Figura 1).En ausencia de doxiciclina, TTS se une a TRE y activamente apaga cualquier transcripción restante. En presencia de doxiciclina, TTS se disocia de TRE y ata el rtTA inducir simultáneamente la expresión del gen diana. Esta capa adicional de rigor es a menudo necesario para expresar proteínas citotóxicas altamente activos ^31-34.

Usando este sistema de doble regulador estrechamente controlada, la cascada apoptótica puede iniciarse en una etapa definida que permite el análisis de si la proteína efectora dado puede interferir con la inducción de apoptosis. Este método no sólo se puede utilizar para estudiar la actividad anti-apoptótica de proteínas efectoras bacterianas sino también para la expresión inducible de proteínas pro-apoptóticas o tóxicos, o para la disección de la interferencia con otras vías de señalización.