L'applicazione di un sistema di espressione inducibile per studiare interferenza di fattori batterici di virulenza con segnalazione intracellulare

La virulenza di molti batteri patogeni Gram-negativi dipende sistemi di secrezione specializzati di dirottare cellule ospiti eucariotiche. I batteri usano questi sistemi di secrezione di iniettare proteine ​​di virulenza batterica (effettori) nella cellula ospite per modulare una varietà di attività cellulari e biochimici. Lo studio delle proteine ​​effettrici ha fornito non solo straordinario di approfondire alcuni temi fondamentali della ospitanti / patogeno, ma anche nella biologia di base delle cellule eucariotiche ^1. Modulazione dell'apoptosi cellula ospite ha dimostrato di essere un meccanismo di virulenza importante per molti patogeni intracellulari, e un certo numero di proteine ​​effettrici modulazione dell'apoptosi sono stati identificati ^2-9. Tuttavia, i loro precisi meccanismi molecolari dell'attività rimangono sfuggente in molti casi.

L'apoptosi, una forma di morte cellulare programmata, svolge un ruolo importante nella risposta immunitaria all'infezione ^10. Due vie principali che portano alla apoptosi averestati individuati: mira i mitocondri (apoptosi intrinseca) o trasduzione diretta del segnale tramite i recettori di morte cellulare a livello della membrana plasmatica (apoptosi estrinseca). Il percorso di morte cellulare intrinseca o mitocondri-mediata è innescato da segnali intracellulari e prevede l'attivazione di Bax e Bak, due membri pro-apoptotici della famiglia di Bcl-2. Questa famiglia è composta da proteine ​​regolatore pro- ed anti-apoptotici che controllano la morte cellulare ^11-14. Attivazione di apoptosi porta a oligomerizzazione di Bax e Bak seguiti da successiva permeabilizzazione della membrana esterna mitocondriale, con conseguente rilascio del citocromo c nel citoplasma. Rilascio del citocromo C avvia attivazione delle caspasi effettrici 3 e 7, attraverso l'attivazione della caspasi 9 nella apoptosoma ^15. Questo porta alla proteolisi di substrati selezionate che, tra l'altro, si traduce nella esposizione della fosfatidilserina sulla superficie cellulare ¹⁶ e libera un DNasi dedicato che frammenta chromatin ^17,18.

Al fine di determinare se all'interno della cascata apoptotica una proteina effettore individuo interferisce, un sistema di espressione inducibile è stato impiegato ^19. I sistemi di regolamentazione per l'espressione condizionale di transgeni sono stati uno strumento prezioso nell'analisi funzione di una proteina all'interno della cellula o la sua importanza per il tessuto, organo e organismo sviluppo, così come durante l'iniziazione, progressione e manutenzione della malattia ^20-23. Tipicamente, i sistemi di controllo inducibili, come il sistema Tet ²⁴ impiegato qui, formano una unità di trascrizione artificiale (vedi Figura 1). Un componente è un fattore di trascrizione artificialmente ingegnerizzato chiamato tTA (tetraciclina-dipendente trascrizione attivatore), formata dalla fusione della trascrizione repressore batterico TetR ²⁵ ad un dominio proteine ​​di mammiferi che media l'attivazione trascrizionale o silenziamento ^24,26. Il secondo componente è un ibridopromoter, chiamato TRE (elemento tetraciclina-sensibile), costituito da un promotore minimo eucariotico, contenente almeno un TATA-box e un sito inizio della trascrizione, unita a più ripetizioni del sito di legame al DNA cognate per TetR, teto ^24,25. Il terzo componente è il ligando naturale TetR, tetraciclina o uno dei suoi derivati, come anhydrotetracycline o doxiciclina ^25. Su ligando aggiunta al mezzo di coltura, TetR perde la sua affinità per této e dissocia dal TRE. Come risultato, la trascrizione del gene bersaglio è abolito. Espressione del transgene può, pertanto, essere strettamente controllata in maniera tempo e dose-dipendente sia in coltura cellulare e in animali ^20,23,24. Con tTA, espressione del transgene verifica costitutivamente, se non in presenza di tetraciclina. Questo può essere uno svantaggio nello studio delle proteine ​​citotossiche o oncogeniche perché tetraciclina deve prima essere rimosso dal sistema, prima transgene expression verifica e gli effetti della proteina bersaglio sulla cellula può essere monitorato. Questo può richiedere molto tempo e non è sempre completa, soprattutto negli animali transgenici ^27. Per affrontare questa limitazione, un mutante TetR con una risposta inversa alla presenza di doxiciclina stato utilizzato per generare un nuovo fattore di trascrizione, rtTA (reverse tTA) ^28. Si lega solo al TRE e, contemporaneamente, attiva la trascrizione in presenza di doxiciclina. Leakiness residua del sistema, cioè., L'espressione del transgene in assenza del fattore di trascrizione TRE-bound, originario sia (i) da effetti di posizione in un sito di integrazione genomica, (ii) dal TRE sé ^29, o (iii) da non -specific legame di tTA / rtTA ^28, è stata affrontata introducendo un silenziatore trascrizionale aggiuntivo, denominato TTS (tetraciclina-dipendente silenziatore trascrizionale) ³⁰ al sistema. Si forma una rete dual regolatore insieme rtTA (vedi Figura 1).In assenza di doxiciclina TTS si lega a TRE e attivamente spegne qualsiasi trascrizione rimanente. In presenza di doxiciclina, TTS dissocia da TRE e rtTA si lega contemporaneamente inducendo l'espressione del gene bersaglio. Questo ulteriore livello di rigorosità è spesso necessario per esprimere proteine ​​citotossiche altamente attivi ^31-34.

L'utilizzo di questo sistema a doppia regolazione strettamente controllata, la cascata apoptotica può essere iniziato con una fase definita che consente l'analisi di se la data proteina effettrici può interferire con l'induzione di apoptosi. Questo metodo non può essere utilizzato solo per studiare l'attività anti-apoptotica di proteine ​​effettrici batteriche, ma anche per l'espressione inducibile di proteine ​​pro-apoptotica o tossici, o per dissezione interferenze con altre vie di segnalazione.