L'application d'un système d'expression inductible pour étudier les interférences de facteurs de virulence bactérienne avec signalisation intracellulaire

La virulence de nombreuses bactéries pathogènes Gram négatif dépend de systèmes de sécrétion spécialisés de détourner des cellules hôtes eucaryotes. Les bactéries utilisent ces systèmes de sécrétion d'injecter des protéines de virulence bactérienne (effecteurs) dans la cellule hôte afin de moduler une variété d'activités cellulaires et biochimiques. L'étude des protéines effectrices a non seulement fourni un remarquable aperçu sur les aspects fondamentaux de interactions hôte / pathogène mais aussi dans la biologie fondamentale des cellules eucaryotes ^1. La modulation de l'apoptose de la cellule hôte a été démontré être un mécanisme de virulence important pour de nombreux agents pathogènes intracellulaires, et un certain nombre de protéines effectrices de modulation de l'apoptose ont été identifiés ^9.2. Cependant, les mécanismes moléculaires précis d'activité demeurent insaisissables dans de nombreux cas.

Apoptose, une forme de mort cellulaire programmée, joue un rôle important dans les réponses immunitaires à l'infection ^10. Deux principales voies conduisant à l'apoptose ontété identifiés: le ciblage des mitochondries (apoptose intrinsèque) ou la transduction directe du signal par les récepteurs de mort cellulaire à la membrane plasmique (apoptose extrinsèque). La voie de la mort cellulaire intrinsèque ou à médiation par les mitochondries est déclenché par des signaux intracellulaires et implique l'activation de Bax et Bak, deux membres pro-apoptotiques de la famille Bcl-2. Cette famille est composée de protéines régulatrices pro- et anti-apoptotiques qui contrôlent la mort des cellules ^11-14. L'activation de l'apoptose conduit à une oligomérisation de Bax et Bak suivi ultérieur par perméabilisation de la membrane externe des mitochondries, ce qui entraîne la libération du cytochrome C dans le cytoplasme. Libération de cytochrome c initie l'activation des caspases effectrices 3 et 7 par activation de la caspase 9 dans le apoptosome ^15. Cela conduit à la protéolyse de substrats sélectionnés qui, entre autres, des résultats de l'exposition de la phosphatidylsérine sur la surface de la cellule ¹⁶ et libère une DNase dédié qui fragmente chromatin ^17,18.

Afin de déterminer l'emplacement dans la cascade apoptotique une protéine effectrice individuel gêne, un système d'expression inductible a été utilisé ^19. Les systèmes de régulation pour l'expression conditionnelle de transgènes ont été un outil précieux dans l'analyse de la fonction d'une protéine dans la cellule ou de son importance pour les tissus, organes et le développement de l'organisme, ainsi que lors de l'initiation, la progression et l'entretien de la maladie ^20-23. Typiquement, les systèmes de contrôle inductibles, tels que le système Tet ²⁴ employée ici, forment une unité de transcription artificielle (voir Figure 1). Un composant est un facteur de transcription appelé tTA conçue artificiellement (transcription activateur tétracycline-dépendant), formé par fusion de répresseur de la transcription bactérienne ²⁵ TetR à un domaine de protéine de mammifère qui médie l'activation transcriptionnelle ou taire ^24,26. Le deuxième composant est un hybridepromoteur, appelé TRE (élément de tetracycline sensible), consistant en un promoteur minimal eucaryote, contenant au moins une boîte TATA et un site d'initiation de transcription, reliée à plusieurs répétitions de la site de liaison à l'ADN apparenté pour TetR, tetO ^24,25. Le troisième composant est le ligand naturel de TetR, la tétracycline ou un de ses dérivés, tels que la doxycycline ou ²⁵ anhydrotétracycline. Lors de l'addition de ligand dans le milieu de culture, TetR perd son affinité pour tetO et se dissocie du TRE. De ce fait, la transcription du gène cible est supprimée. L'expression du transgène peut, ainsi, être étroitement contrôlé d'une manière temps et dose-dépendante à la fois dans la culture cellulaire et chez les animaux ^20,23,24. Avec tTA, l'expression du transgène se produit de manière constitutive, sauf en présence d'une tetracycline. Cela peut être un inconvénient dans l'étude des protéines cytotoxiques ou oncogènes parce tétracycline doit d'abord être retiré du système, avant transgène expression se produit et les effets de la protéine cible sur la cellule peut être surveillé. Cela peut prendre beaucoup de temps et ne sont pas toujours complète, en particulier dans ²⁷ des animaux transgéniques. Pour remédier à cette limitation, un mutant avec TetR une réponse inverse de la présence de doxycycline a été utilisé pour générer un nouveau facteur de transcription, rtTA (tTA inverse) ^28. Il se lie uniquement au TRE et, de façon concomitante, active la transcription en présence de doxycycline. Perméabilité résiduelle du système, à savoir., L'expression du transgène en l'absence de TRE lié facteur de transcription, provenant soit (i) d'effets de position à un site d'intégration génomique, (ii) à partir du TRE lui-même ^29, ou (iii) de non spécifique de la liaison de tTA / rtTA ^28, a été adressée par l'introduction d'un silencieux de transcription supplémentaire, appelée TTS (dépendant de la tétracycline silencieux transcription) ³⁰ dans le système. Il forme un réseau de régulateur double avec rtTA (voir Figure 1).En l'absence de doxycycline, TTS se lie à TRE et arrête toute transcription reste activement. En présence de doxycycline, TTS dissocie de TRE et rtTA lie induire simultanément l'expression du gène cible. Cette couche supplémentaire de rigueur est souvent nécessaire pour exprimer des protéines cytotoxiques très actifs ^31-34.

Grâce à ce système à double régulateur étroitement contrôlé, la cascade apoptotique peut être initié à une étape définie permettant l'analyse de savoir si la protéine effecteur donné peut interférer avec induction d'apoptose. Cette méthode ne peut pas être utilisé pour étudier l'activité anti-apoptotique des protéines effectrices bactériennes mais également pour l'expression inductible de protéines pro-apoptotiques ou toxiques, ou pour disséquer les interférences avec d'autres voies de signalisation.