Het toepassen van een induceerbare Expression Systeem om interferentie van bacteriële virulentiefactoren met intracellulaire signalering Studie

De virulentie van vele Gram-negatieve bacteriële pathogenen is afhankelijk van gespecialiseerde secretie systemen om eukaryotische gastheercellen kapen. Bacteriën gebruiken dit secretiesystemen bacteriële virulentie eiwitten (effectoren) in de gastheercel injecteren van verschillende cellulaire en biochemische activiteiten te moduleren. De studie van effector eiwitten heeft niet alleen verstrekt opmerkelijk inzicht in de fundamentele aspecten van gastheer / pathogeen interacties, maar ook in de fundamentele biologie van eukaryote cellen ^1. Modulatie van gastheercel apoptose is aangetoond dat een belangrijke virulentie mechanisme voor vele intracellulaire pathogenen en een aantal effector eiwitten moduleren van apoptose geïdentificeerd ^2-9. Echter, de precieze moleculaire mechanisme ter blijven ongrijpbaar in veel gevallen.

Apoptose is een vorm van geprogrammeerde celdood, speelt een belangrijke rol bij de immuunrespons op infectie ^10. Twee belangrijke routes die leiden tot apoptosegeïdentificeerd: gericht op de mitochondria (intrinsieke apoptose) of directe transductie van het signaal via celdood receptoren in het plasmamembraan (extrinsieke apoptose). De intrinsieke of mitochondriën gemedieerde celdood wordt veroorzaakt door intracellulaire signalen en omvat de activering van Bax en Bak, twee pro-apoptotische leden van de Bcl-2 familie. Deze familie is samengesteld uit pro- en anti-apoptotische regulator eiwitten die celdood ^11-14 regelen. Activering van apoptose leidt tot oligomerisatie van Bax en Bak gevolgd door achtereenvolgende permeabilisatie van het mitochondriale buitenste membraan, waardoor cytochroom C introductie in het cytoplasma. Cytochroom C afgifte initieert activering van de effector caspasen 3 en 7 tot activatie van caspase 9 in de apoptosoom ^15. Dit leidt tot proteolyse van geselecteerde substraten die onder andere resulteert in de blootstelling van fosfatidylserine aan het celoppervlak ¹⁶ en maakt een speciaal DNase die ch fragmentenromatin ^17,18.

Om te bepalen waar in de apoptotische cascade individuele effector eiwit interfereert, een induceerbaar expressiesysteem werd toegepast ^19. Regulerende systemen voor voorwaardelijke expressie van transgenen hebben een waardevol hulpmiddel bij het ​​analyseren van de functie van een eiwit in de cel of het belang ervan voor weefsel, orgaan en organisme ontwikkeling, evenals tijdens initiatie, progressie en het onderhoud van de ziekte ^20-23 geweest. Gewoonlijk induceerbare systemen, zoals het Tet-systeem ²⁴ hier toegepast, vormen een kunstmatige transcriptie-eenheid (zie figuur 1). Eén component is een kunstmatig ontwikkelde transcriptiefactor genaamd tTA (tetracycline-afhankelijke transcriptie activator), gevormd door fusie van de bacteriële transcriptie-repressor TetR ²⁵ aan een zoogdierpatiënt eiwitdomein die transcriptionele activatie of silencing ^24,26 bemiddelt. De tweede component is een hybridepromoter, aangeduid als TRE (tetracycline-responsief element), bestaande uit een eukaryotische minimale promoter, die ten minste een TATA-box en een transcriptie-initiatieplaats, verbonden met meerdere herhalingen van de cognate-DNA bindingsplaats voor TetR, tetO ^24,25. De derde component is het natuurlijke ligand van TetR, tetracycline of een van zijn derivaten, zoals anhydrotetracycline en doxycycline ^25. Na ligand toevoeging aan het kweekmedium, TetR verliest zijn affiniteit voor tetO en dissocieert van het TRE. Daardoor wordt transcriptie van het doelgen opgeheven. Transgene expressie kan derhalve worden strak gecontroleerd in een tijds- en dosisafhankelijke manier in zowel celkweek als bij dieren ^20,23,24. Met tTA, transgenexpressie treedt constitutief, behalve bij aanwezigheid van een tetracycline. Dit kan een nadeel in de studie van cytotoxische of oncogene eiwitten omdat tetracycline moet eerst uit het systeem worden verwijderd, voordat transgene expression optreedt en het doeleiwit effecten op de cel kan worden gecontroleerd. Dit kan tijdrovend en niet altijd volledig, vooral in transgene dieren ^27. Om deze beperking te pakken, een TetR mutant met een inverse reactie op de aanwezigheid van doxycycline werd gebruikt om een nieuwe transcriptiefactor genereren rtTA (reverse tTA) ^28. Het bindt alleen aan de TRE en, tegelijkertijd, transcriptie activeert in aanwezigheid van doxycycline. Residuele lekkages van het systeem, dwz., Transgene expressie in de afwezigheid van TRE-gebonden transcriptiefactor, van hetzij (i) van positie-effecten op genomische integratieplaats, (ii) vanaf het TRE ²⁹ zelf, of (iii) uit niet -specifieke binding van tTA / rtTA ^28, werd door de opneming van een extra transcriptiesilencerdomein, genaamd TTS (tetracycline-afhankelijke transcriptionele geluiddemper) ³⁰ aan het systeem. Het vormt een dubbele regulator vergeaeld rtTA (zie figuur 1).Bij afwezigheid van doxycycline, tts bindt aan TRE en actief wordt uitgeschakeld resterende transcriptie. In de aanwezigheid van doxycycline, tts dissocieert van TRE en rtTA bindt gelijktijdig induceren van expressie van het doelwitgen. Deze extra laag stringentie moet vaak zeer actieve cytotoxische eiwitten ^31-34 expressie.

Met deze strak dual-regulator systeem kan de apoptotische cascade bij een bepaalde stap waarbij wordt onderzocht of de gegeven effector eiwit kunnen interfereren met apoptose-inductie worden gestart. Deze werkwijze kan niet alleen worden gebruikt om de anti-apoptotische activiteit van bacteriële effector eiwitten te bestuderen, maar ook voor de induceerbare expressie van pro-apoptotische of toxische eiwitten of ontleden interferentie met andere signaalwegen.