تطبيق نظام التعبير محرض لدراسة التدخل من العوامل البكتيرية الفوعة مع اشارة بين الخلايا
Summary
The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.
Abstract
تقنية المعروضة هنا يسمح احد لتحليل في الخطوة التي بروتين الهدف، أو بدلا من ذلك جزيء صغير، تتفاعل مع مكونات مسار الإشارات. وتستند هذه الطريقة، من جهة، على التعبير عن محرض من بروتين معين لبدء الحدث الإشارات في خطوة محددة ومقررة مسبقا في شلال يشير المحدد. التعبير يصاحب ذلك، من ناحية أخرى، من الجينات في المصالح ثم يسمح للمحقق لتقييم ما إذا كان النشاط من البروتين المستهدف أعرب يقع المنبع أو المصب لهذا الحدث مما يشير بدأت، اعتمادا على قراءات من مسار الإشارات التي يتم الحصول عليها. هنا، تم اختيار سلسلة أفكارك كمسار إشارات محددة لإثبات وظائف البروتوكول. البكتيريا المسببة للأمراض، مثل الكوكسيلا البورنيتية، نقل من البروتينات المستجيب التي تتداخل مع الحث موت الخلايا المضيفة في الخلية المضيفة لضمان بقاء البكتيريا في الخلية وللترويج لنشر في الكائن الحي. وC. بروتين المستجيب البورنيتية CaeB يمنع بشكل فعال موت الخلايا المضيفة بعد استحثاث موت الخلايا المبرمج مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية أو مع staurosporine. لتضييق على الخطوة التي CaeB يتداخل مع انتشار الإشارة أفكارك، وأعرب عن البروتينات المحددة مع جيدا اتسم بالنشاط المساعد على أفكارك عابر بطريقة الدوكسيسيكلين محرض. إذا يعمل CaeB المنبع من هذه البروتينات، وموت الخلايا المبرمج المضي قدما دون عوائق. إذا يعمل CaeB المصب، سيتم تحول دون موت الخلايا. كانت البروتينات الاختبار المختارة باكس، الذي يعمل على مستوى الميتوكوندريا، وكاسباس 3، وهو الأنزيم البروتيني الجلاد كبير. CaeB يتداخل مع موت الخلايا الناجم عن باكس التعبير، ولكن ليس عن طريق كاسباس 3 التعبير. CaeB، وبالتالي يتفاعل مع تتالي أفكارك بين هذه البروتينات اثنين.
Introduction
الفوعة للعوامل الممرضة سلبية الغرام البكتيرية تعتمد على أنظمة إفراز المتخصصة لخطف الخلايا المضيفة حقيقية النواة. البكتيريا تستخدم هذه النظم إفراز لحقن البروتينات الفوعة البكتيرية (المؤثرات) في الخلية المضيفة لتعديل مجموعة متنوعة من الأنشطة الخلوية والكيمياء الحيوية. قدمت دراسة البروتينات المستجيب ليس فقط نظرة ملحوظة في الجوانب الأساسية للمضيف / التفاعلات الممرض ولكن أيضا في البيولوجيا الأساسية للخلايا حقيقية النواة 1. وقد تبين أن التشكيل من موت الخلايا المبرمج الخلية المضيفة أن تكون آلية الفوعة هامة لكثير من الكائنات الممرضة داخل الخلايا، كما تم تحديد عدد من البروتينات المستجيب تحوير الخلايا 2-9. ومع ذلك، آلياتها الجزيئية دقيقة من النشاط لا تزال بعيدة المنال في كثير من الحالات.
موت الخلايا المبرمج، وهو شكل من موت الخلية المبرمج، يلعب دورا هاما في الاستجابة المناعية للإصابة 10. مسارين الرئيسية المؤدية إلى موت الخلايا المبرمج لهاتم تحديد: استهداف الميتوكوندريا (موت الخلايا المبرمج الجوهرية) أو تنبيغ المباشر للإشارة عن طريق مستقبلات موت الخلايا في الغشاء البلازمي (موت الخلايا المبرمج خارجي). يتم تشغيل مسار موت الخلايا الذاتية أو بوساطة الميتوكوندريا بواسطة إشارات بين الخلايا وتتضمن تفعيل باكس وباك، وهما عضوان الموالية لأفكارك من عائلة بي سي إل 2. وتتكون هذه العائلة من البروتينات منظم المؤيدة والمضادة للأفكارك التي تتحكم في موت الخلايا 11-14. تفعيل الخلايا يؤدي إلى oligomerization من باكس وباك تليها permeabilization لاحق من الغشاء الخارجي الميتوكوندريا، مما أدى إلى الإفراج السيتوكروم C إلى السيتوبلازم. الإفراج السيتوكروم C يبدأ تفعيل caspases المستجيب 3 و 7 من خلال تفعيل كاسباس 9 في apoptosome 15. وهذا يؤدي إلى التحلل البروتيني من ركائز مختارة، من بين أمور أخرى، يؤدي إلى تعرض فسفاتيديل على سطح الخلية 16 و يحرر الدناز مخصص أن شظايا الفصلromatin 17،18.
من أجل تحديد مكان ضمن سلسلة أفكارك بروتين المستجيب الفردية يتدخل، كان يعمل بنظام التعبير محرض 19. وكانت الأجهزة التنظيمية للتعبير مشروط من الجينات المحورة أداة لا تقدر بثمن في تحليل وظيفة البروتين داخل الخلية أو أهميتها بالنسبة للأنسجة، جهاز والتنمية الكائن الحي، وكذلك أثناء بدء والتقدم والحفاظ على المرض 20-23. عادة، ونظم التحكم محرض، مثل نظام تيت 24 يعملون هنا، تشكل وحدة النسخ الاصطناعية (انظر الشكل 1). عنصر واحد هو عامل النسخ هندسيا بشكل مصطنع دعا نقل واكتساب التكنولوجيا (التي تعتمد على التتراسيكلين النسخ المنشط)، التي شكلتها انصهار النسخ كاظمة البكتيرية TetR 25 إلى مجال البروتين الثدييات التي تتوسط تفعيل النسخي أو إسكات 24،26. العنصر الثاني هو هجينالمروج، ووصف TRE (عنصر التتراسيكلين استجابة)، التي تتألف من الحد الأدنى من المروج حقيقية النواة، التي تحتوي على ما لا يقل عن TATA مربع وموقع بدء النسخ، وانضم إلى تكرار متعددة من موقع ملزم DNA وما شابه ذلك لTetR، TETO 24،25. العنصر الثالث هو يجند الطبيعي للTetR، التتراسيكلين أو أحد مشتقاته، مثل anhydrotetracycline أو دوكسي 25. على يجند بالإضافة إلى مستنبت، TetR يفقد تقارب من أجل تيتو وتنأى عن TRE. ونتيجة لذلك، يتم إلغاء نسخ من الجين المستهدف. التعبير التحوير يمكن، بالتالي، أن تسيطر بإحكام بطريقة الزمنية وتعتمد على الجرعة في كل من زراعة الخلايا والحيوانات 20،23،24. مع نقل واكتساب التكنولوجيا، يحدث التحوير التعبير بشكل جوهري، إلا في وجود التتراسيكلين. هذا يمكن أن يكون العيب في دراسة السامة للخلايا أو أنكجنيك البروتينات لأن التتراسيكلين أولا أن يتم إزالتها من النظام، قبل التحوير expressioن يحدث ويمكن رصد آثار البروتين المستهدف على الخلية. هذا يمكن أن يكون مضيعة للوقت وليس دائما كاملة، خصوصا في الحيوانات المعدلة وراثيا 27. لمعالجة هذا القيد، تم استخدام متحولة TetR مع استجابة عكسية لوجود الدوكسيسيكلين لتوليد عامل النسخ الجديدة، rtTA (عكس TTA) 28. فإنه يلزم فقط لتري، وبصورة متزامنة، وينشط النسخ في وجود دوكسي. التسرب المتبقية للنظام، أي، التعبير التحوير في غياب عامل النسخ متجهة الى TRE، منشؤها إما (ط) من آثار الموقف في موقع التكامل الجيني، (ب) من TRE نفسها 29، أو (ج) من غير -specific ملزمة للنقل واكتساب التكنولوجيا / rtTA 28، وقد وجهت عن طريق إدخال كاتم الصوت النسخي إضافية، ووصف تحويل النص إلى كلام (التي تعتمد على التتراسيكلين كاتم الصوت النسخي) 30 إلى النظام. أنها تشكل شبكة تنظيمية مزدوجة مع rtTA (انظر الشكل 1).في غياب الدوكسيسيكلين، تحويل النص إلى كلام بربط TRE والعمل بنشاط على إيقاف أي النسخ المتبقية. في ظل وجود الدوكسيسيكلين، تحويل النص إلى كلام تنأى عن TRE وrtTA بربط حمل في وقت واحد التعبير عن الجينات المستهدفة. هذه طبقة إضافية من الصرامة ضرورية في كثير من الأحيان للتعبير عن البروتينات السامة للخلايا نشطة للغاية 31-34.
باستخدام هذا النظام المزدوج المنظم لرقابة مشددة، ويمكن البدء في سلسلة أفكارك في خطوة محددة تسمح بتحليل ما إذا كان البروتين المستجيب معينة يمكن أن تتداخل مع الخلايا الاستقراء. لا يمكن استخدام هذا الأسلوب فقط لدراسة النشاط المضادة للأفكارك البروتينات المستجيب البكتيرية ولكن أيضا للتعبير عن محرض من البروتينات الموالية لأفكارك أو السامة أو لتشريح التدخل في مسارات إشارات أخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
العديد من أنواع البكتيريا المسببة للأمراض تؤوي أنظمة إفراز لإفراز أو نقل من البروتينات المستجيب البكتيرية إلى داخل الخلية المضيفة. هذه البروتينات المستجيب لديها القدرة على تعديل العمليات ومسارات في الخلية المضيفة، مما يسمح للبكتيريا من أجل البقاء وتكرار داخل مكان…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) through the Collaborative Research Initiative 796 (SFB796) to A.L. and C.B., and through the ERA-NET PathoGenoMics 3rd call to A.L.
Materials
| DMEM | life technologies | 31966-021 | |
| FCS | Biochrom | S0115 | |
| Pen/Strep | life technologies | 15140-122 | |
| OptiMEM | life technologies | 51985 | |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365752001 | |
| Geneticin | Roth | CP11.3 | |
| Polyethylenimine | Polyscienes | 23966 | |
| Doxycycline | Sigma Aldrich | D9891 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 165-8000EDU | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad | 170-3940 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Scientific | 26616 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| anti-GFP | life technologies | A6455 | |
| anti-cleaved PARP | BD Bioscience | 611038 | |
| anti-actin | Sigma Aldrich | A2066 | |
| Mouse IgG (H+L)-HRPO | Dianova | 111-035-062 | |
| Rabbit IgG (H+L)-HRPO | Dianova | 111-035-045 | |
| ECL Western Blotting Substrate | Thermo Scientific | 32106 | |
| Restore Plus Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | 46428 |
References
- Galán, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).
- Banga, S., et al. Legionella pneumophila inhibits macrophage apoptosis by targeting pro-death members of the Bcl2 protein family. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (12), 5121-5126 (2007).
- Laguna, R. K., Creasey, E. A., Li, Z., Valtz, N., Isberg, R. R. A Legionella pneumophila-translocated substrate that is required for growth within macrophages and protection from host cell death. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (49), 18745-18750 (2006).
- Schmid, M. C., et al. A translocated bacterial protein protects vascular endothelial cells from apoptosis. PLoS Pathog. 2 (11), e115 (2006).
- Nogueira, C. V., Carey, K. L., Roy, C. R. Inhibition of pathogen-induced apoptosis by a Coxiella burnetiitype IV effector protein. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (44), 18997-19001 (2010).
- Rudel, T., Kepp, O., Kozjak-Pavlovic, V. Interactions between bacterial pathogens and mitochondrial cell death pathways. Nat Rev Microbiol. 8 (10), 693-705 (2010).
- Klingenbeck, L., Eckart, R. A., Berens, C., Lührmann, A. The Coxiella burnetii type IV secretion system substrate CaeB inhibits intrinsic apoptosis at the mitochondrial level. Cell Microbiol. 15 (4), 675-687 (2012).
- Raymond, B., et al. Subversion of trafficking, apoptosis, and innate immunity by type III secretion system effectors. Trends Microbiol. 21 (8), 430-441 (2013).
- Eckart, R. A., et al. Antiapoptotic activity of Coxiella burnetii effector protein AnkG is controlled by p32-dependent trafficking. Infect Immun. 82 (7), 2763-2771 (2014).
- Byrne, G. I., Ojcius, D. M. Chlamydia and apoptosis: life and death decisions of an intracellular pathogen. Nat Rev Microbiol. 2 (10), 802-808 (2004).
- Delft, M. F., Huang, D. C. S. How the Bcl-2 family of proteins interact to regulate apoptosis. Cell Res. 16 (2), 203-213 (2006).
- Willis, S. N., Adams, J. M. Life in the balance: how BH3-only proteins induce apoptosis. Curr Opin Cell Biol. 17 (6), 617-625 (2005).
- Shamas-Din, A., Kale, J., Leber, B., Andrews, D. W. Mechanisms of action of Bcl-2 family proteins. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (4), a008714 (2013).
- Cory, S., Adams, J. M. The Bcl2 family: regulators of the cellular life-or-death switch. Nat Rev Cancer. 2 (9), 647-656 (2002).
- Adams, J. M., Cory, S. Apoptosomes: engines for caspase activation. Curr Opin Cell Biol. 14 (6), 715-720 (2002).
- Suzuki, J., Denning, D. P., Imanishi, E., Horvitz, H. R., Nagata, S. Xk-related protein 8 and CED-8 promote phosphatidylserine exposure in apoptotic cells. Science. 341 (6144), 403-406 (2013).
- Cory, S. Cell death throes. Proc Natl Acad Sci USA. 95 (21), 12077-12079 (1998).
- Enari, M., et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature. 391 (6662), 43-50 (1998).
- Fussenegger, M. The impact of mammalian gene regulation concepts on functional genomic research, metabolic engineering, and advanced gene therapies. Biotechnol Prog. 17 (1), 1-51 (2001).
- Felsher, D. W. Reversibility of oncogene-induced cancer. Curr Opin Genet Dev. 14 (1), 37-42 (2004).
- Maherali, N., et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).
- Kozlova, E. N., Berens, C. Guiding differentiation of stem cells in vivo by tetracycline-controlled expression of key transcription factors. Cell Transplant. 21 (12), 2537-2554 (2012).
- Reijmers, L., Mayford, M. Genetic control of active neural circuits. Front Mol Neurosci. 2, 27 (2009).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc Natl Acad Sci USA. 89 (12), 5547-5551 (1992).
- Hillen, W., Berens, C. Mechanisms underlying expression of Tn10 .encoded tetracycline resistance. Annu Rev Microbiol. 48, 345-369 (1994).
- Deuschle, U., Meyer, W. K., Thiesen, H. J. Tetracycline-reversible silencing of eukaryotic promoters. Mol Cell Biol. 15 (4), 1907-1914 (1995).
- Robertson, A., Perea, J., Tolmachova, T., Thomas, P. K., Huxley, C. Effects of mouse strain, position of integration and tetracycline analogue on the tetracycline conditional system in transgenic mice. Gene. 282 (1-2), 65-74 (2002).
- Gossen, M., et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268 (5218), 1766-1769 (1995).
- Rang, A., Will, H. The tetracycline-responsive promoter contains functional interferon-inducible response elements. Nucleic Acids Res. 28 (5), 1120-1125 (2000).
- Freundlieb, S., Schirra-Müller, C., Bujard, H. A tetracycline controlled activation/repression system with increased potential for gene transfer into mammalian cells. J Gene Med. 1 (1), 4-12 (1999).
- Knott, A., et al. An optimized conditional suicide switch using doxycycline-dependent expression of human tBid. Cancer Biol Ther. 4 (5), 532-536 (2005).
- Danilchanka, O., et al. An outer membrane channel protein of Mycobacterium tuberculosis with exotoxin activity. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (18), 6750-6755 (2014).
- Danke, C., et al. Adjusting transgene expression levels in lymphocytes with a set of inducible promoters. J Gene Med. 12 (6), 501-515 (2010).
- Maueröder, C., Chaurio, R. A., Platzer, S., Munoz, L. E., Berens, C. Model systems for rapid and slow induction of apoptosis obtained by inducible expression of pro-apoptotic proteins. Autoimmunity. 46 (5), 329-335 (2013).
- Srinivasula, S. M., et al. Generation of constitutively active recombinant caspases-3 and -6 by rearrangement of their subunits. J Biol Chem. 273 (17), 10107-10111 (1998).
- Baron, U., Freundlieb, S., Gossen, M., Bujard, H. Co-regulation of two gene activities by tetracycline via a bidirectional promoter. Nucleic Acids Res. 23 (17), 3605-3606 (1995).
- Anastassiadis, K., et al. A predictable ligand regulated expression strategy for stably integrated transgenes in mammalian cells in culture. Gene. 298 (2), 159-172 (2002).
- Qu, Z., et al. Homogeneity and long-term stability of tetracycline-regulated gene expression with low basal activity by using the rtTA2S-M2 transactivator and insulator-flanked reporter vectors. Gene. 327 (1), 61-73 (2004).
- Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).
- Agha-Mohammadi, S., et al. Second-generation tetracycline-regulatable promoter: repositioned tet operator elements optimize transactivator synergy while shorter minimal promoter offers tight basal leakiness. J Gene Med. 6 (7), 817-828 (2004).
- Pluta, K., Luce, M. J., Bao, L., Agha-Mohammadi, S., Reiser, J. Tight control of transgene expression by lentivirus vectors containing second-generation tetracycline-responsive promoters. J Gene Med. 7 (6), 803-817 (2005).
- Hoffmann, A., Villalba, M., Journot, L., Spengler, D. A novel tetracycline-dependent expression vector with low basal expression and potent regulatory properties in various mammalian cell lines. Nucleic Acids Res. 25 (5), 1078-1079 (1997).
- Loew, R., Heinz, N., Hampf, M., Bujard, H., Gossen, M. Improved Tet-responsive promoters with minimized background expression. BMC Biotechnol. 10, 81 (2010).
- Heinz, N., et al. Retroviral and transposon-based tet-regulated all-in-one vectors with reduced background expression and improved dynamic range. Hum Gene Ther. 22 (2), 166-176 (2011).
- Toniatti, C., Bujard, H., Cortese, R., Ciliberto, G. Gene therapy progress and prospects: transcription regulatory systems. Gene Ther. 11 (8), 649-657 (2004).
- Ye, H., Fussenegger, M. Synthetic therapeutic gene circuits in mammalian cells. FEBS Lett. 588 (15), 2537-2544 (2014).
