Generación de células madre pluripotentes inducidas a partir de Frozen Buffy Coats utilizando para no integrar episomal plásmidos

En 2006, el grupo de Shinya Yamanaka ¹ demostró por primera vez que las células somáticas de ratones y seres humanos adultos se pueden convertir en un estado pluripotente por la expresión ectópica de cuatro factores de reprogramación (octubre-4, Sox-2, Klf-4, y c-Myc), generando las llamadas células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) ^2. CMPI-paciente específico se parecen mucho a las células madre embrionarias humanas (hESCs) en términos de la morfología, la proliferación y la capacidad de diferenciarse en los tipos de células de tres germinales (mesodermo, endodermo y ectodermo), mientras que carece de los problemas éticos asociados a la utilización de hESCs y derivación posible rechazo inmune ^3. Por lo tanto, iPSCs aparece como una de las fuentes más importantes de las células específicas del paciente para la investigación básica, la detección de drogas, el modelado de la enfermedad, la evaluación de la toxicidad y efectos de medicina regenerativa ^4.

Varios enfoques se han utilizado para la generación de IPSC: vectores de integración virales⁽⁵ retrovirus, lentivirus ^6), virales no-integración de vectores (adenovirus ^7), Sendai virus ^8, transposones BAC ^9, vectores episomales ^{10, 11} proteínas o ARN entrega ^12. Aunque el uso de métodos mediada por virus puede conducir a la reprogramación de alta eficiencia, los vectores virales se integran en el genoma de células huésped y por lo tanto potencial mutagénesis de inserción al azar, alteración permanente de la expresión génica, y la reactivación de transgenes silenciados durante la diferenciación no se puede excluir ^13.

Para hacer iPSCs más seguro para la medicina regenerativa, se han hecho esfuerzos para derivar iPSCs sin la integración de ADN exógeno en genomas celulares. Aunque se han desarrollado vectores virales y transposones sujetos a impuestos especiales, todavía no está claro si las secuencias del vector cortos, que inevitablemente permanecen en las células transducidas después de la escisión, y transposasa expresión, podrían inducir alteración en la celdaular funcionan ^13. A pesar de su alta eficiencia de reprogramación, virus Sendai representa un enfoque caro y llegar a través de las preocupaciones de licencia con la empresa que desarrolló este sistema tiene el potencial de limitar su aplicación en estudios de traducción. Además, la necesidad de la introducción directa de proteínas y ARN requiere la entrega múltiplo de la reprogramación de moléculas con las limitaciones técnicas inherentes esto conlleva la introducción, y la eficiencia general de reprogramación es muy baja ^14. De nota, métodos virales libres y no integrador rentables basados ​​en el uso de plásmidos episomales se han reportado con éxito para la reprogramación de fibroblastos de la piel ^15. En concreto, en el presente trabajo hemos decidido utilizar plásmidos episomales-integración libre de comerciales disponibles, como se informó anteriormente ^10,15.

Hasta la fecha, los fibroblastos de la piel representan el tipo de célula donante más popular ^5. Sin embargo, otras fuentes de células han sido éxitosfully reprogramado en iPSCs incluyendo queratinocitos ^16, células madre mesenquimales de médula ósea ^17, las células del estroma adiposo ^18, folículos pilosos ^19, y las células de la pulpa dental ^20. El aislamiento de estas células requiere procedimientos quirúrgicos, y se necesitan varias semanas para la expansión de células in vitro con el fin de establecer un cultivo celular primario.

En este sentido, la selección de iniciar tipo de célula es crítica y es igualmente importante ser capaz de producir células iPS a partir de tejidos de fácil acceso y menos invasivas como la sangre. Tanto las células mononucleares de sangre de cordón (CBMNCs) ^21,22 y células mononucleares de sangre periférica (PBMNCs) ^14,22-24 representan fuentes adecuadas de células para la derivación de células iPS.

Aunque la eficiencia de adulto PBMNC reprogramación es 20-50 veces menor que la de CBMNCs ^22, siguen siendo el tipo de célula más conveniente para el propósito de muestreo. EnDe hecho, el muestreo PBMNC tiene la ventaja de ser mínimamente invasiva, y además, estas células no requieren extensa expansión in vitro antes de los experimentos de reprogramación. Hasta la fecha, diferentes protocolos han informado de que PBMNCs después de la separación en gradiente de densidad pueden ser congeladas y descongeladas días a varios meses después de la congelación y se expandieron para pocos días antes de la reprogramación en iPSCs ^22,23. Sin embargo, en lo que somos conscientes no hay informes han descrito reprogramación de PBMNCs de buffy abrigos congelados. Es importante destacar que, buffy abrigos congelados recogidos sin separación en gradiente de densidad representan las muestras de sangre más comunes almacenados en bancos de datos genéticos a gran escala a partir de los estudios de población, lo que representa una piscina de fácil acceso de material para la producción de IPSC que evita además la recogida de muestras.

Aquí nos presenta por primera vez la generación de CMPI-virales libres de capas leucocitarias congelados humanos, sobre la base de un protocolo previamente descrito ^22. EnAdemás, CMPI se generaron a partir PBMNCs congelados obtenidos después de la separación en gradiente de densidad, como un protocolo de control para los resultados PBMNC gradiente de densidad no purificada.