Генерация индуцированные плюрипотентные стволовые клетки из замороженных Баффи пальто с помощью неинтегрирующих Эписомные плазмиды

В 2006 году группа Шинья Яманака ¹ продемонстрирована впервые, что соматические клетки взрослых мышей и человека может быть преобразован в плюрипотентных государства эктопической экспрессии четырех перепрограммирования факторов (октябрь-4, Sox-2, КФК-4, и C-Мус), генерации так называемых индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) ^2. Конкретного пациента иПСК напоминают человеческие эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) в терминах морфологии, распространения и способности различать в трех типов зародышевых клеток-(мезодерма, энтодермы и эктодермы), а не хватает этические проблемы, связанные с использованием ЭСК и обход возможно иммунное отторжение ^3. Таким образом, иПСК в качестве одного из самых важных источников конкретного пациента клетки для фундаментальных исследований, скрининга наркотиков, моделирования заболевания, оценки токсичности и регенеративной медицины целей ^4.

Несколько подходы были использованы для генерации IPSC: вирусные векторы, интегрирующие(Ретровирус ^5, лентивирус ^6), вирусный без учета векторов (аденовирус ^7), Сендай-вирус ^{8, 9} ВАС транспозонов, эписомные векторы ^10, белки ¹¹ или доставка РНК ^12. Хотя использование вирусных опосредованной методов может привести к высокой эффективности перепрограммирования, вирусные векторы интеграции в геном клеток-хозяев и, следовательно, потенциальным случайным инсерционного мутагенеза, постоянное изменение экспрессии генов, и реактивации молчащих трансгенов во время дифференцировки не может быть исключена ^13.

Чтобы сделать более безопасным иПСК для регенеративной медицины, были предприняты усилия для получения ИПСК без интеграции экзогенной ДНК в клеточных геномов. Хотя подакцизных вирусные векторы и транспозоны были разработаны, до сих пор неясно ли короткие последовательности вектора, которые неизбежно остаются в трансдуцированных клеток после удаления, и транспозазы выражение, может вызвать изменение в клеткеулар функционировать ^13. Несмотря на высокую эффективность перепрограммирования, вирус Сендай представляет собой дорогостоящий подход и сквозные проблемы лицензирования с компанией, которая разработала эту систему есть потенциал, чтобы ограничить его применение в трансляционных исследований. Кроме того, необходимость прямого введения белков и РНК требует многократного перепрограммирования доставку молекул с присущими технических ограничений Это вносит, и общая эффективность перепрограммирование очень низкая ^14. Следует отметить, что рентабельные вирусные свободные и неинтегрирующих методы, основанные на использовании Эписомные плазмид успешно отчиталась за перепрограммирования фибробластов кожи ^15. В частности, в настоящей работе мы решили использовать коммерческие доступные интеграции, свободной Эписомные плазмиды, как сообщалось ранее ^10,15.

На сегодняшний день, фибробласты кожи представляют собой наиболее популярный тип донорских клеток ^5. Тем не менее, другие источники клеток были Successfully перепрограммировать в ИПСК, включая кератиноциты ^16, костного мозга мезенхимальных стволовых клеток жировой, ¹⁷ стромальных клеток ^18, волосяных фолликулов ^19, и пульпа клетки ^20. Выделение таких клеток требуется хирургических процедур, и через несколько недель, необходимых для расширения в пробирке клеток для того, чтобы установить первичной культуры клеток.

В этом свете, выбор, начиная тип клеток имеет решающее значение, и это в равной степени важно, чтобы иметь возможность производить ИПСК из легко доступных и менее инвазивных тканей, таких как кровь. Оба одноядерные клетки пуповинной крови (CBMNCs) ^21,22 и мононуклеарных клеток периферической крови (PBMNCs) ^14,22-24 представляют подходящие источники клеток для вывода ИПСК.

Хотя эффективность взрослого PBMNC перепрограммирования 20-50 раз ниже, чем у CBMNCs ^22, они остаются наиболее удобным типом клеток для целей отбора проб. ВДело в том, выборки PBMNC имеет то преимущество, что минимально инвазивных, и, кроме того, эти клетки не требуют экстенсивного расширения в пробирке Перед перепрограммированием экспериментов. На сегодняшний день, различные протоколы сообщили, что после разделения PBMNCs градиента плотности могут быть заморожены и разморожены дней до нескольких месяцев после замораживания и расширена в течение нескольких дней, прежде чем перепрограммирования в ИПСК ^22,23. Тем не менее, насколько нам известно, никаких сообщений не описано перепрограммирование PBMNCs из замороженных лейкоцитарных пленок. Важно отметить, что замороженные охристые пальто, собранные без разделения в градиенте плотности представляют собой наиболее общие образцы крови, хранящиеся в крупных биобанках из популяционных исследований, тем самым обеспечивая легкодоступный бассейн материала для производства IPSC, чтобы избежать дальнейшего сбора образца.

В этом мы сообщаем впервые поколение вирусных свободной ИПСК из замороженных лейкоцитарных пленок человека, на основе ранее описанной протокола ^22. ВКроме того, иПСК были получены из замороженных PBMNCs, полученных после разделения в градиенте плотности, как протокол управления для градиента плотности не очищенных результатов PBMNC.