Geração de pluripotentes induzidas a partir de células-tronco Congelado Buffy Coats usando não-integração epissomais Plasmids

Em 2006, o grupo de Shinya Yamanaka ¹ demonstraram pela primeira vez que as células somáticas de ratos e seres humanos adultos pode ser convertido para um estado pluripotente pela expressão ectópica de quatro factores de reprogramação (Oct-4, Sox-2, 4-Klf, e c-Myc), gerando as chamadas células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) ^2. IPSCs específica para cada paciente se assemelham células estaminais embrionárias humanas (hESCs) em termos de morfologia, proliferação e capacidade de se diferenciarem em tipos de células germinativas (três mesoderme, endoderme e da ectoderme), enquanto falta as preocupações de ordem ética associados à utilização de hESCs e ignorando possível rejeição imunológica ^3. Assim, iPSCs aparecer como uma das mais importantes fontes de células específicas do paciente para a pesquisa básica, a seleção da droga, modelagem de doença, avaliação de toxicidade e efeitos de medicina regenerativa ^4.

Várias abordagens têm sido utilizadas para a geração de iPSC: vectores de integração virais(Retrovírus ^5, lentivírus ^6), viral não-integração de vetores (adenovírus ^7), Sendai-vírus ^{8, 9} BAC transposons, vetores epissomais ^10, proteínas ¹¹ ou ¹² RNA entrega. Embora o uso de métodos mediada por vírus pode levar a uma alta eficiência de reprogramação, os vectores virais integrar-se no genoma das células hospedeiras e, por conseguinte, mutagénese de inserção aleatória potencial, alteração permanente da expressão do gene, e reactivação de transgenes silenciados durante a diferenciação não pode ser excluído ^13.

Para fazer iPSCs mais seguro para a medicina regenerativa, foram feitos esforços para derivar iPSCs sem a integração de DNA exógeno em genomas celulares. Embora os vectores virais ele sujeitos e transposões foram desenvolvidos, ainda não é claro se as sequências de vector, o que inevitavelmente curtas permanecem nas células transduzidas após excisão, e expressão de transposase, poderia induzir alteração na célulaular funcionar ^13. Apesar da sua alta eficiência de reprogramação, vírus Sendai representa uma abordagem caro e preocupações atingem-through de licenciamento com a empresa que desenvolveu este sistema tem o potencial de limitar a sua aplicação em estudos translacionais. Além disso, a necessidade de introdução directa de proteínas e RNA requer entrega múltiplo de reprogramação moléculas com as limitações técnicas inerentes Isso introduz e eficiência global de reprogramação é muito baixa ^14. De nota, métodos virais livres e não-integração eficaz em termos de custos com base no uso de plasmídeos epissómicos têm sido relatadas com sucesso para a reprogramação de fibroblastos da pele ^15. Especificamente, no presente trabalho, decidimos usar plasmídeos epissomais livre de integração disponíveis comerciais, conforme relatado anteriormente ^10,15.

Até à data, os fibroblastos da pele representam o mais popular tipo de célula doadora ^5. No entanto, outras fontes de células foram successfully reprogramado em iPSCs incluindo queratinócitos ^16, medula óssea células-tronco mesenquimais, células do estroma ¹⁷ adiposo ^{18, 19} folículos pilosos e as células da Polpa Dentária ^20. O isolamento destas células requer procedimentos cirúrgicos, e várias semanas são necessários para a expansão in vitro de células, a fim de estabelecer uma cultura de células primárias.

Neste contexto, a selecção do tipo de células de partida é crítica e é igualmente importante ser capaz de produzir a partir de tecidos iPSCs facilmente acessíveis e menos invasivas, tais como sangue. Ambas as células mononucleares do sangue do cordão umbilical (CBMNCs ^21,22) e células mononucleares de sangue periférico ^(14,22-24) PBMNCs representam fontes adequadas de células para a derivação de iPSCs.

Embora a eficiência do adulto PBMNC reprogramação é 20-50 vezes mais baixa do que a de CBMNCs ^22, eles continuam a ser o tipo de célula mais conveniente para efeitos de amostragem. Emfato, a amostragem PBMNC tem a vantagem de ser minimamente invasivo, e, além disso, estas células não necessitam de grande expansão in vitro antes de experiências de reprogramação. Até à data, os protocolos diferentes têm relatado que PBMNCs após separação por gradiente de densidade pode ser congelado e descongelado dias a vários meses após a congelação e expandido por poucos dias antes de reprogramação em iPSCs ^22,23. No entanto, tanto quanto nós estamos cientes há relatos têm descrito a reprogramação da PBMNCs de crostas inflamatórias congelados. Importante, cremes leucocitários congelados recolhidos sem separação por gradiente de densidade representam as amostras de sangue mais comuns armazenadas em bancos de recursos biológicos de grande escala a partir de estudos populacionais, representando, assim, uma piscina facilmente acessível de material para a produção iPSC que evita ainda a coleta de amostras.

Aqui nós relatamos pela primeira vez a geração de iPSCs virais-livre de cremes leucocitários humanos congelados, com base em um protocolo previamente descrito ^22. EmAdicionalmente, foram gerados a partir iPSCs PBMNCs congelados obtidos após separação por gradiente de densidade, tal como um protocolo de controlo para os resultados PBMNC gradiente de densidade não-purificadas.