非統合ソームプラスミドを用いて凍結軟膜から誘導多能性幹細胞の生成

2006年には、山中伸弥のグループが¹ KLF-4、成体マウスおよびヒトからの体細胞は、4つの再プログラミング因子（Oct-4の、ソックス-2の異所性発現によって多能性状態に変換することができることを初めて実証し、 C-Mycの）、いわゆる人工多能性幹細胞（性^IPSC）2を生成します。患者特異性IPSC密接形態、増殖、およびhESCの使用に関連する倫​​理的な問題を欠くと迂回し、三生殖細胞型（中胚葉、内胚葉及び外胚葉）に分化する能力の点でヒト胚性幹細胞（hESC）の似ています可能な免疫拒絶^3。このように、性IPSCは、基礎研究、薬物スクリーニング、疾患モデリング、毒性の評価、および再生医療の目的のために⁴患者特異的細胞の最も重要な源の一つとして表示されます。

いくつかのアプローチは、iPS細胞の生成のために使用されている：ウイルスベクターを統合します（レトロウイルス^5、レンチウイルス^6）、ウイルス非組み込み型ベクター（アデノウイルス^7）、センダイウイルス^8、BACトランスポゾン^9、エピソームベクター^10、タンパク質¹¹またはRNAの送達^12。ウイルス媒介方法の使用は、高効率のリプログラミングにつながることができますが、ウイルスベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、したがって、潜在的なランダム挿入変異、遺伝子発現の永久的な変化、および分化の間沈黙導入遺伝子の再活性化は^、13を除外することはできません。

再生医療用iPS細胞をより安全にするために、努力は携帯のゲノムへの外来DNAの組込みなしでiPS細胞を誘導するためになされています。切除可能なウイルスベクターおよびトランスポゾンが開発されているが、それは必然的に短く切除後に形質導入​​した細胞中に残存ベクター配列、およびトランスポザーゼの発現は、細胞内変化を誘発することができるかどうかまだ不明ですウラル機能^13。その高い初期化効率にもかかわらず、センダイウイルスは、高価なアプローチを表し、このシステムを開発した会社でリーチスルーライセンスの懸念は、翻訳の研究でその用途を制限する可能性があります。さらに、タンパク質およびRNAの直接導入の必要性は、これが導入されて、固有の技術的な限界で分子を再プログラミングする複数の配信を必要とし、全体の再プログラミング効率は¹⁴非常に低いです。注目すべきは、エピソームプラスミドの使用に基づいて、費用対効果の高い無料のウイルスおよび非統合の方法は、正常皮膚線維芽細胞¹⁵の再プログラミングのために報告されています。具体的には、本研究で我々は、以前に^10,15を報告したように、市販の統合フリーエピソームプラスミドを使用することにしました。

現在までに、皮膚線維芽細胞は、最も人気のあるドナー細胞型^5を表します。しかし、他の細胞源は大成功していますsfullyケラチノサイト^16、骨髄間葉系幹細胞^17、脂肪間質細胞^18、毛包¹⁹および歯髄細胞²⁰を含むiPS細胞に再プログラム。これらの細胞の単離は、外科的処置を必要とし、数週間の初代細胞培養を確立するために、 インビトロ細胞増殖に必要とされます。

この観点から、細胞型の開始の選択は重要であり、それは、血液などの容易にアクセス可能で低侵襲性の組織からiPS細胞を生成することができることが同様に重要です。臍帯血単核細胞^{（CBMNCs）21,22}と、末梢血単核細胞^{（PBMNCs）14,22-24}両方が性IPSCの導出のための細胞の適切な供給源を表します。

成人PBMNCの再プログラミングの効率がCBMNCs ²²のそれよりも20〜50倍低いが、それらは、サンプリング目的のために最も便利な細胞型のままです。で実際には、PBMNCサンプリングは低侵襲であるという利点があり、加えて、これらの細胞は、再プログラミング実験の前に、インビトロで広範な拡張を必要としません。現在までに、異なるプロトコルは、密度勾配分離後PBMNCsを凍結し、解凍した日数ヶ月に凍結後と性IPSC ^22,23に再プログラミングする前に数日のために拡張することができることを報告しています。それにもかかわらず、限り我々が知っているように報告は凍結バフィーコートからPBMNCsの再プログラミングを説明していません。重要なことは、密度勾配分離することなく収集凍結軟膜は、このように、試料採取を回避するiPS細胞の製造のための材料の容易にアクセスできるプールを表す、集団研究から大規模なバイオバンクに保存されている最も一般的な血液サンプルを表します。

本明細書中で、私たちは以前に記載されたプロトコル²²に基づいて、初めて人間の冷凍軟膜からのウイルスフリー性IPSCの生成を報告しています。でまた、性IPSCは、非密度勾配精製PBMNC結果の制御プロトコルとして、密度勾配分離後に得られた凍結PBMNCsから生成されました。