Generazione di pluripotenti indotte cellule staminali da congelata Buffy cappotti con non-integrazione episomiale Plasmidi

Nel 2006, il gruppo di Shinya Yamanaka ¹ ha dimostrato per la prima volta che le cellule somatiche di topi adulti e gli esseri umani possono essere convertiti in uno stato pluripotente dall'espressione ectopica di quattro fattori di riprogrammazione (ottobre-4, Sox-2, KLF-4, e c-Myc), generando le cosiddette cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) ^2. IPSCs paziente-specifiche sono molto simili a cellule staminali embrionali umane (hESC) in termini di morfologia, la proliferazione e la capacità di differenziarsi in tipi di cellule germinali (tre mesoderma, endoderma ed ectoderma), mentre mancano le preoccupazioni etiche legate all'uso di hESC e bypass possibile rigetto immunitario ^3. Così, iPSCs appaiono come una delle più importanti fonti di cellule paziente-specifiche per la ricerca di base, lo screening di stupefacenti, modelli di malattia, la valutazione della tossicità, e fini di medicina rigenerativa ^4.

Diversi approcci sono stati utilizzati per la generazione iPSC: vettori virali integrazione(Retrovirus ^5, lentivirus ^6), virale non integrando vettori (adenovirus ^7), Sendai-virus ^8, BAC trasposoni ^9, vettori episomiale ^10, proteine ^​​11 o consegna RNA ^12. Sebbene l'uso di metodi di virus-mediata può portare ad alta efficienza riprogrammazione, vettori virali integrano nel genoma delle cellule ospiti e quindi potenziale casuale mutagenesi inserzionale, alterazione permanente di espressione genica, e la riattivazione di transgeni tacere durante la differenziazione non può essere esclusa ^13.

Per rendere più sicuro iPSCs per la medicina rigenerativa, sono stati compiuti sforzi per derivare iPSCs senza l'integrazione di DNA esogeno in genomi cellulari. Sebbene siano stati sviluppati vettori virali soggetti ad accisa e trasposoni, è ancora chiaro se sequenze vettore brevi, che inevitabilmente rimangono nelle cellule trasdotte dopo escissione e transposase espressione, potrebbero indurre alterazioni nella cellalare funzionano ^13. Nonostante la sua alta efficienza riprogrammazione, virus Sendai rappresenta un approccio costoso e raggiungere, attraverso problemi di licenza con la società che ha sviluppato questo sistema di avere il potenziale per limitarne l'applicazione negli studi traslazionali. Inoltre, la necessità di introduzione diretta di proteine ​​e RNA richiede consegna multiplo di riprogrammazione molecole con le limitazioni tecniche insite questo introduce, e l'efficienza complessiva riprogrammazione è molto bassa ^14. Di nota, metodi virali libere e non integrare convenienti basate sull'uso di plasmidi episomiale sono stati riportati con successo per la riprogrammazione dei fibroblasti cutanei ^15. In particolare, in questo lavoro abbiamo deciso di utilizzare commerciali plasmidi episomiale senza integrazione disponibili, come riportato in precedenza ^10,15.

Fino ad oggi, fibroblasti cutanei rappresentano il più popolare tipo di cellula donatrice ^5. Tuttavia, altre fonti di cellule sono stati successfully riprogrammato in iPSCs compresi cheratinociti ^16, del midollo osseo cellule staminali mesenchimali ^17, cellule stromali adipose ^18, follicoli piliferi ^19, e le cellule della polpa dentale ^20. L'isolamento di queste cellule richiede procedure chirurgiche, e diverse settimane sono necessari per l'espansione delle cellule in vitro allo scopo di stabilire una coltura cellulare primaria.

In questa luce, la selezione del tipo di cellula di partenza è critico ed è altrettanto importante essere in grado di produrre iPSCs dai tessuti facilmente accessibili e meno invasive come sangue. Entrambe le cellule mononucleate del sangue del cordone (CBMNCs) ^21,22 e cellule mononucleari di sangue periferico (PBMNCs) ^14,22-24 rappresentano idonee fonti di cellule per la derivazione di iPSCs.

Sebbene l'efficienza di adulti PBMNC riprogrammazione è 20-50 volte inferiore a quella del CBMNCs ^22, rimangono il tipo di cella più conveniente per scopo campionamento. InInfatti, campionamento PBMNC ha il vantaggio di essere minimamente invasiva, e in aggiunta, queste cellule non richiedono vasta espansione in vitro prima degli esperimenti di riprogrammazione. Fino ad oggi, i protocolli differenti hanno riferito che PBMNCs dopo la separazione gradiente di densità possono essere congelati e scongelati giorni a diversi mesi dopo il congelamento e ampliato per alcuni giorni prima della riprogrammazione in iPSCs ^22,23. Tuttavia, per quanto a nostra conoscenza segnalazioni hanno descritto una riprogrammazione della PBMNCs da buffy coats congelati. È importante sottolineare che, buffy coats congelati raccolti senza separazione gradiente di densità rappresentano i campioni di sangue più comuni memorizzati nella biobanche di grandi dimensioni provenienti da studi di popolazione, rappresentando così una piscina facilmente accessibile di materiale per la produzione di IPSC che evita ulteriormente la raccolta dei campioni.

Qui riportiamo per la prima volta la generazione di iPSCs-virali privi di buffy coats congelati umani, sulla base di un protocollo precedentemente descritto ^22. InInoltre, sono stati generati da iPSCs PBMNCs congelati ottenuti dopo la separazione gradiente di densità, come un protocollo di controllo per i risultati PBMNC gradiente di densità non depurati.