דור של גזע תאים המושרה pluripotent מקפוא באפי מעילים באמצעות Episomal פלסמידים ללא שילוב
Summary
תאים מושרה pluripotent גזע (iPSCs) מהווים מקור של רקמות מטופל ספציפי ליישומים קליניים ומחקר בסיסי. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לתכנת מחדש תאים אנושיים היקפיים mononuclear הדם (PBMNCs) המתקבלים ממעיילי אפים קפואים לiPSCs הנגיפי ללא שימוש בפלסמידים episomal הלא שילוב.
Abstract
ניתן לתכנות מחדש תאים סומטיים לתאי גזע pluripotent מושרה (iPSCs) על ידי לאלץ את הביטוי של ארבעה גורמי שעתוק (אוקטובר-4, סוקס-2, KLF-4, ו- c-Myc), הביע בדרך כלל על ידי תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) . בשל הדמיון שלהם עם hESCs, iPSCs הפך כלי חשוב לרפואת רגנרטיבית מטופל ספציפי פוטנציאלית, הימנעות סוגיות אתיות הקשורות לhESCs. כדי להשיג תאים מתאימים ליישום קליני, iPSCs ללא transgene צריך להיות שנוצר כדי למנוע הפעלה מחדש transgene, ביטוי גנים שהשתנה ובידול מוטעה. יתר על כן, שיטת תכנות מחדש יעילה והזולה ביותר היא צורך להפיק iPSCs מספיק למטרות טיפוליות. בהתחשב בצורך הזה, גישת פלסמיד episomal שילוב הלא-יעילה היא הבחירה עדיפה לגזירת iPSC. כיום סוג התא הנפוץ ביותר בשימוש למטרות תכנות מחדש הוא fibroblasts, הבידוד של אשר דורש ביופסית רקמה, אניהליך כירורגי nvasive עבור המטופל. לכן, דם היקפי אדם מייצג את הרקמה נגישה ביותר ולפחות פולשנית לדור iPSC.
במחקר זה, פרוטוקול חסכוני ויראלית ללא שימוש בפלסמידים episomal הלא שילוב דווח לדור של iPSCs מתאי אנושיים היקפיים mononuclear הדם (PBMNCs) המתקבלים ממעיילי אפים קפואים לאחר צנטריפוגה דם השלמה וללא הפרדת שיפוע צפיפות.
Introduction
בשנת 2006, הקבוצה של שיניה יאמאנאקה 1 הוכיחה בפעם הראשונה שתאים סומטיים מעכברים ובני האדם מבוגרים יכולים להיות מומרים למדינת pluripotent על ידי ביטוי חוץ רחמי של ארבעה גורמי תכנות מחדש (אוקטובר-4, סוקס-2, KLF-4, ו ג-Myc), יצירת התאים שנקרא המושרה pluripotent הגזע (iPSCs) 2. iPSCs מטופל ספציפי דומה מאוד בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) במונחים של מורפולוגיה, הפצה והיכולת להתמיין לסוגי תאי שלוש-נבט (המזודרם, האנדודרם והאאקטודרם) ואילו חסרי דאגות האתיות הקשורות לשימוש בhESCs ועקיף דחייה חיסונית אפשרית 3. לפיכך, iPSCs מופיע כאחד מהמקורות החשובים ביותר של תאי חולה ספציפי למחקר בסיסי, הקרנת סמים, דוגמנות מחלה, הערכה של רעילות, ומטרות רפואת רגנרטיבית 4.
כמה גישות שימשו במשך דור iPSC: וקטורי שילוב נגיפיים(רטרו-וירוס 5, lentivirus 6), ויראלי וקטורי שילוב-עישון (אדנווירוס 7), סנדאי וירוס 8, transposons BAC 9, וקטורי episomal 10, חלבונים 11 או משלוח RNA 12. למרות שהשימוש בשיטות תיווך וירוס יכול להוביל לתכנות מחדש יעילות גבוהה, וקטורים ויראליים להשתלב בגנום של תאי מארח וmutagenesis insertional האקראי ולכן פוטנציאל, שינוי קבוע של ביטוי גנים, והפעלה מחדש של transgenes הושתק במהלך התמיינות לא ניתן לשלול 13.
כדי להפוך iPSCs בטוח יותר לרפואת רגנרטיבית, נעשו מאמצים כדי להפיק iPSCs ללא שילוב של DNA אקסוגני לתוך הגנום תאי. למרות וקטורים ויראליים excisable וtransposons פותחו, זה עדיין לא ברור אם רצפים קצרים וקטור, שבהכרח יישארו בתאי transduced לאחר כריתה, וtransposase ביטוי, יכולים לגרום לשינוי בתאular לתפקד 13. למרות היעילות הגבוהה תכנות מחדש שלה, וירוס סנדאי מייצג גישה יקרה ולהגיע דרך חששות רישוי עם החברה שפיתחה מערכת זו יש הפוטנציאל להגביל יישומה במחקרי translational. יתר על כן, את הצורך בהקדמה ישירה של חלבונים ו- RNA דורש משלוח מרובה של תכנות מחדש מולקולות עם המגבלות טכניות הטבועות זו מציגה, ויעילות תכנות מחדש כוללת היא נמוכה מאוד 14. ראוי לציין, שיטות שילוב הלא-נגיפיות-חופשיות וחסכוניות המבוססות על השימוש בפלסמידים episomal דווחו בהצלחה לתכנות מחדש של fibroblasts עור 15. באופן ספציפי, בעבודה הנוכחית החלטנו להשתמש בפלסמידים episomal מסחריים זמינים ללא אינטגרציה, כפי שדווח בעבר 10,15.
עד כה, fibroblasts העור מייצג את סוג תא התורם הפופולרי ביותר 5. עם זאת, מקורות תא אחרים היו succesתכנות מחדש sfully לiPSCs כולל קרטינוציטים 16, בתאי גזע mesenchymal מח עצם 17, תאי סטרומה שומן 18, שיער הזקיקים 19, ותאי עיסת שיניים 20. הבידוד של תאים אלה דורש פרוצדורות כירורגיות, וכמה שבועות יש צורך במבחנה הרחבת תא כדי להקים תרבות תא ראשונית.
לאור זאת, הבחירה של מתחיל סוג התא היא קריטית וחשוב באותה מידה להיות מסוגל לייצר iPSCs מרקמות נגישים ופחות פולשני כמו דם. שני תאי mononuclear דם טבורי (CBMNCs) 21,22 והיקפי mononuclear דם תאים (PBMNCs) 14,22-24 מייצגים מקורות מתאימים של תאים לגזרה של iPSCs.
למרות היעילות של תכנות מחדש PBMNC המבוגר היא 20-50 פעמים נמוכה מזה של 22 CBMNCs, הם נשארים סוג התא הנוח ביותר למטרה דגימה. בלמעשה, יש דגימת PBMNC את היתרון של להיות פולשנית, ובנוסף, תאים אלה אינם דורשים הרחבה רבה במבחנה לפני ניסויי תכנות מחדש. עד כה, פרוטוקולים שונים דיווחו כי PBMNCs לאחר הפרדת שיפוע הצפיפות אפשר להקפיא ולהפשיר ימים לכמה חודשים לאחר ההקפאה ומורחבת לכמה ימים לפני תכנות מחדש לiPSCs 22,23. עם זאת, ככל שאנו מודעים לא דווחנו תארו תכנות מחדש של PBMNCs ממעיילי אפים קפואים. חשוב לציין, מעילי אפים קפואים שנאספו ללא הפרדת שיפוע צפיפות מייצגים את דגימות דם הנפוצות ביותר מאוחסנות בbiobanks בקנה מידה הגדול ממחקרי אוכלוסייה, ובכך מייצג את בריכה נגישה של חומר לייצור iPSC שימנע איסוף דגימה נוסף.
במסמך זה אנו מדווחים לראשונה את הדור של iPSCs הנגיפי-חופשי ממעיילי אפים קפואים אנושיים, המבוסס על פרוטוקול שתואר קודם לכן 22. בבנוסף, iPSCs נוצרו מPBMNCs הקפוא מתקבל לאחר הפרדת שיפוע הצפיפות, כפרוטוקול בקרה לתוצאות PBMNC שיפוע שאינו צפיפות מטוהרת.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעבר, הדרך היחידה להשיג תאי גזע pluripotent אדם נושאים מוטציה גנטית מסוימת היה לגייס הורים עוברים אבחון גנטי טרום השרשה וליצור תאי גזע עובריים מblastocysts הושלכה 31,32. שימוש בגישה תכנות מחדש, חוקרים יכולים כעת ליצור iPSCs מחולים נושאים כמעט כל גנוטיפ. האפשרות להתחיל משורת תא…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The study was supported by the Ministry of Health and Department of Educational Assistance, University and Research of the Autonomous Province of Bolzano and the South Tyrolean Sparkasse Foundation.
Materials
| Sodium Citrate buffered Venosafe Plastic Tube | Terumo | VF-054SBCS07 | |
| Ammodium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Potassium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 60339 | |
| EDTA disodium powder | Sigma-Aldrich | E5134 | 0.5 M solution |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare Life Sciences | 17-5442-02 | Polysucrose solution for density gradient centrifugation |
| Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) | Gibco | 21056-023 | No phenol red |
| Ham's F-12 | Mediatech | 10-080-CV | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS -X) | Gibco | 51500-056 | 1X (Stock: 100X) |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Gibco | 11905031 | 1X (Stock: 100X) |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | Final Concentration at 200 µM |
| Recombinant Human Stem Cell Factor (SCF) | PeproTech | 300-07 | 100 ng/ml (Stock:100 µg/ml) |
| Recombinant Human Interleukin-3 (IL-3) | PeproTech | 200-03 | 10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml) |
| Recombinant Human Insulin-like Growth Factor (IGF-1) | PeproTech | 100-11 | 40 ng/ml (Stock: 40 µg/ml) |
| Recombinant Human Erythropoietin (EPO) | R&D Systems | 287-TC-500 | 2 U/ml (Stock: 50 U/ml) |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915 | 1 μM (Stock: 1 mM) |
| Human Holo-Transferrin | R&D Systems | 2914-HT | 100 μg/ml (Stock: 20 mg/ml) |
| Amniomax II | Gibco | 11269016 | Medium for cytogenetic analysis |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 5850 | Medium for iPSC feeder-free culture |
| Knockout DMEM | Gibco | 10829-018 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030-024 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140-050 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | 0.1 mM (Stock: 50 mM) |
| Sodium Butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | 0.25 mM (Stock: 0.5 M) |
| Recombinant Human FGF basic, 145 aa | R&D Systems | 4114-TC | 10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml) |
| Y-27632 dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503 | 10 µM (Stock: 10 mM) |
| Fetal Defined Bovine Serum | Hyclone | SH 30070.03 | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Merck-Millipore | ES-006-B | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced | BD Biosciences | 354230 | |
| Collagenase, Type IV | Gibco | 17104-019 | 1 mg/ml (Stock: 10 mg/ml) |
| Accutase | PAA Laboratories GmbH | L11-007 | Cell detachment solution |
| Mouse Embryonic Fibroblast (CF1) | Global Stem | GSC-6201G | 1*106 cells/6 well plate |
| Plasmid pCXLE-hOCT3/4-shp53-F | Addgene | 27077 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Plasmid pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Plasmid pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Plasmid pCXLE-EGFP | Addgene | 27082 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Alkaline Phosphatase Staining Kit | Stemgent | 00-0009 | |
| Anti-Stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4) Antibody | Merck-Millipore | MAB4304 | 1/250 |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Merck-Millipore | MAB4360 | 1/250 |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Merck-Millipore | MAB4381 | 1/250 |
| Anti-Oct-3/4 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-9081 | 1/500 |
| Anti-Nanog Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-33759 | 1/500 |
| Anti-Troponin I Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-15368 | 1/500 |
| Anti-α-Actinin (Sarcomeric) Antibody | Sigma-Aldrich | A7732 | 1/250 |
| Neuronal Class III ß-Tubulin (TUJ1) Antibody | Covance Research Products Inc | MMS-435P-100 | 1/500 |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody | Calbiochem | 657012 | 1/200 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse | Molecular Probes | A-11029 | 1/1000 |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Rabbit | Molecular Probes | A-21429 | 1/1000 |
| Ultra-Low Attachment Cell Culture 6-well plate | Corning | 3471 | |
| Trizol Reagent | Ambion | 15596-018 | reagent for RNA extraction |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11754050 | Reverse transcriptase kit |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5124 | |
| CFX96 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 185-5195 | |
| Experion Automated Electrophoresis System | Bio-Rad | 700-7000 | Instrument to check RNA integrity |
| Experion RNA Highsense Analysis kit | Bio-Rad | 7007105 | Reagent kit to check RNA integrity |
| Dissecting microscope (SteREO Discovery V12 ) | Zeiss | 495007 | |
| NeonTransfection System 100 µL Kit | Invitrogen | MPK10025 | Reagent kit for electroporation |
| Neon Transfection System | Invitrogen | MPK5000 | Instrument used for electroporation |
| NanoDrop UV/Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | Instrument for DNA/RNA quantification |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid purification kit |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat. Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).
- Drews, K., Jozefczuk, J., Prigione, A., Adjaye, J. Human induced pluripotent stem cells–from mechanisms to clinical applications. J. Mol. Med. (Berl). 90 (7), 735-745 (2012).
- Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells). Curr. Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Sommer, A. G., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector. J. Vis. Exp. (68), e4327 (2012).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
- Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).
- Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat. Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell. Stem Cell. 4 (6), 472-476 (2009).
- Warren, L., Ni, Y., Wang, J., Guo, X. Feeder-free derivation of human induced pluripotent stem cells with messenger RNA. Sci. Rep. 2, 657 (2012).
- Stadtfeld, M., Hochedlinger, K. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. Genes Dev. 24 (20), 2239-2263 (2010).
- Chou, B. K., et al. Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures. Cell Res. 21 (3), 518-529 (2011).
- Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat. Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).
- Streckfuss-Bomeke, K., et al. Comparative study of human-induced pluripotent stem cells derived from bone marrow cells, hair keratinocytes, and skin fibroblasts. Eur. Heart J. 34 (33), 2618-2629 (2013).
- Miyoshi, N., et al. Reprogramming of mouse and human cells to pluripotency using mature microRNAs. Cell. Stem Cell. 8 (6), 633-638 (2011).
- Wang, Y., et al. Induced pluripotent stem cells from human hair follicle mesenchymal stem cells. Stem Cell. Rev. 9 (4), 451-460 (2013).
- Beltrao-Braga, P. C., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from human immature dental pulp stem cells. Cell Transplant. 20 (11-12), 1707-1719 (2011).
- Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell. Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
- Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nat. Protoc. 7 (11), 2013-2021 (2012).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell. Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
- Geti, I., et al. A practical and efficient cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells from adults: blood-derived endothelial progenitor cells. Stem Cells Transl. Med. 1 (12), 855-865 (2012).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. , Appendix 3-Appendix 3B (2001).
- Hasegawa, K., et al. Comparison of reprogramming efficiency between transduction of reprogramming factors, cell-cell fusion, and cytoplast fusion. Stem Cells. 28 (8), 1338-1348 (2010).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), 2565 (2010).
- Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Mol Aspects Med. 27 (2-3), 126-129 (2006).
- Meraviglia, V., et al. Human chorionic villus mesenchymal stromal cells reveal strong endothelial conversion properties. Differentiation. 83 (5), 260-270 (2012).
- Caspersson, T., Zech, L., Johansson, C. Analysis of human metaphase chromosome set by aid of DNA-binding fluorescent agents. Exp Cell Res. 253 (2), 302-304 (1999).
- Alikani, M., Munne, S. Nonviable human pre-implantation embryos as a source of stem cells for research and potential therapy. Stem Cell. Rev. 1 (4), 337-343 (2005).
- Tropel, P., et al. High-efficiency derivation of human embryonic stem cell lines following pre-implantation genetic diagnosis. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 46 (3-4), 376-385 (2010).
- Hanna, J., et al. Direct cell reprogramming is a stochastic process amenable to acceleration. Nature. 462 (72-73), 595-601 (2009).
- Li, H., et al. The Ink4/Arf locus is a barrier for iPS cell reprogramming. Nature. 460 (7259), 1136-1139 (2009).
- Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
- Lindner, S. E., Sugden, B. The plasmid replicon of Epstein-Barr virus: mechanistic insights into efficient, licensed, extrachromosomal replication in human cells. Plasmid. 58 (1), 1-12 (2007).
