Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus Gefrorene Buffy Coats mit Non-Integration episomalen Plasmiden

In 2006 hat die Gruppe von Shinya Yamanaka ¹ gezeigt, zum ersten Mal, dass Körperzellen aus adulten Mäusen und Menschen können durch ektopische Expression von vier Reprogrammierungsfaktoren (Oct-4, Sox-2, Klf-4, und in einem pluripotenten Zustand umgewandelt werden c-Myc), die Erzeugung der sogenannten induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS) ^2. Patientenspezifische iPSCs ähneln menschlichen embryonalen Stammzellen (hES) in Bezug auf die Morphologie, Proliferation und die Fähigkeit, in die drei Keimzelltypen (Mesoderm, Endoderm und Ektoderm) differenzieren, während ohne die ethische Bedenken auf die Verwendung von HES-Zellen und Bypass zugeordnet mögliche Immunabstoßung ^3. Somit iPSCs erscheinen als eine der wichtigsten Quellen von patientenspezifischen Zellen für die Grundlagenforschung, Drug Screening, Krankheitsmodelle, Bewertung der Toxizität und der regenerativen Medizin Qualität ^4.

Es wurden mehrere Ansätze für iPSC Generation verwendet: viralen Integrationsvektoren(Retrovirus ^5, Lentivirus ^6), virale nicht-Integrationsvektoren (Adenovirus ^{7), Sendai-Virus-8,} BAC Transposons ^9, episomale Vektoren ^{10, 11} Proteine ​​oder RNA-Lieferung ^12. Obwohl die Verwendung von Virus-vermittelte Methoden können eine hohe Effizienz Neuprogrammierung führen, in das Genom der Wirtszellen und daher potentielle Zufalls Insertionsmutagenese integrieren virale Vektoren können permanente Veränderung der Genexpression und Reaktivierung von Schweigen Transgenen während der Differenzierung nicht ausgeschlossen werden ^13.

Um iPSCs sicherer für die regenerative Medizin zu machen, wurden Anstrengungen unternommen, um iPSCs ohne die Integration von exogener DNA in zelluläre Genome abzuleiten. Obwohl verbrauch viralen Vektoren und Transposons entwickelt wurden, ist es noch unklar, ob die kurze Vektorsequenzen, die zwangsläufig verbleiben in den transduzierten Zellen nach der Exzision und Transposaseexpression könnte Veränderung Zelle induzierendere funktionieren ^13. Trotz seiner hohen Effizienz Neuprogrammierung, Sendai-Virus stellt eine teure Vorgehensweise und zu erreichen, durch Lizenz Anliegen mit dem Unternehmen, die dieses System entwickelt, haben das Potenzial, ihre Anwendung in der translationalen Studien zu begrenzen. Darüber hinaus die Notwendigkeit für eine direkte Einführung von Proteinen und RNA erfordert mehrere Lieferung der Neuprogrammierung Moleküle mit den innewohnenden technischen Beschränkungen dieser führt, und die allgemeine Anpassung Effizienz ist sehr gering ^14. Zu beachten ist, kosteneffektiv virale frei und nicht-integrierenden Methoden basierend auf der Verwendung von episomalen Plasmiden wurden erfolgreich für die Umprogrammierung der Hautfibroblasten ¹⁵ gemeldet. Insbesondere wird in der vorliegenden Arbeit haben wir beschlossen, im Handel erhältlichen Integration freien episomalen Plasmiden verwenden, wie bereits berichtet ^10,15.

Bisher Haut-Fibroblasten stellen die beliebtesten Spenderzelle Typ ^5. Aber auch andere Zellquellen wurden successfully in iPSCs einschließlich Keratinozyten ^16, Knochenmark mesenchymale Stammzellen ^17. Fettgewebe Stromazellen ¹⁸ umprogrammiert, Haarfollikel ¹⁹ und Zahnmark-Zellen ^20. Die Isolierung dieser Zellen erfordert chirurgischen Verfahren und mehreren Wochen werden für in vitro-Zellexpansion, um eine primäre Zellkultur zu etablieren benötigt.

In diesem Licht ist die Auswahl der Ausgangszelltyp kritisch und es ist ebenso wichtig, iPSCs von leicht zugänglichen und weniger invasiv Geweben wie Blut erzeugen. Beide Nabelschnurblut mononukleäre Zellen (CBMNCs) ^21,22 und periphere mononukleäre Blutzellen (PBMNC) ^14,22-24 repräsentieren geeignete Quellen von Zellen für die Ableitung iPSCs.

Obwohl die Effizienz der erwachsenen PBMNC Umprogrammieren 20-50 mal niedriger als die von CBMNCs ^22, bleiben sie die bequemste Zelltyp für die Beprobung. InTatsächlich hat PBMNC Probenahme den Vorteil, dass minimal-invasive, und außerdem sind diese Zellen nicht umfangreiche Expansion in vitro vor der Reprogrammierung Experimente erfordern. Bislang wurden unterschiedliche Protokolle berichtet, dass PBMNCs nach Dichtegradienten-Trennung nach dem Gefrieren eingefroren und aufgetaut Tage bis mehrere Monate und für einige Tage expandiert, bevor für die Umprogrammierung in iPSCs ^22,23. Dennoch, soweit wir wissen, keine Berichte Umprogrammierung PBMNCs aus gefrorenen Buffy Coats beschrieben. Wichtig ist, dass gefrorene Buffy Coats ohne Dichtegradiententrennung gesammelt stellen die in großem Umfang von Biobanken Bevölkerungsstudien gespeichert und stellt somit eine leicht zugängliche Pool von Material für iPSC Produktion, die weitere Probennahme vermeidet häufigsten Blutproben.

Berichten wir hier zum ersten Mal die Erzeugung von Virusfrei iPSCs aus menschlichen gefrorenen buffy coats, basierend auf einem zuvor beschriebenen Protokoll ^22. InAußerdem wurden aus gefrorenen iPSCs PBMNCs nach Dichtegradiententrennung erhalten erzeugt als Steuerprotokoll für die nicht-Dichtegradienten gereinigt PBMNC Ergebnisse.