Génération de cellules souches pluripotentes induites à partir de Frozen Buffy Manteaux en utilisant non-intégration épisomique plasmides

En 2006, le groupe de Shinya Yamanaka ¹ a démontré pour la première fois que des cellules somatiques de souris et les humains adultes peuvent être convertis en un état ​​pluripotent par l'expression ectopique de quatre facteurs de reprogrammation (Oct-4, Sox-2, KLF-4, et c-Myc), générer les soi-disant cellules souches pluripotentes induites (CISP) ^2. CSPi spécifiques au patient ressemblent étroitement à des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) en termes de morphologie, la prolifération et la capacité de se différencier en types de cellules de trois de germe (mésoderme, endoderme et ectoderme) tout en manquant les préoccupations éthiques liées à l'utilisation des CSEh et contournement possible rejet immunitaire ^3. Ainsi, CSPi apparaît comme l'une des sources les plus importantes de cellules spécifiques au patient pour la recherche fondamentale, le dépistage des drogues, la modélisation de la maladie, l'évaluation de la toxicité, et à des fins de médecine régénérative ^4.

Plusieurs approches ont été utilisées pour la génération iPSC: vecteurs d'intégration virale⁽⁵ rétrovirus, les lentivirus ^6), virale non des vecteurs d'intégration (adénovirus ^7), Sendai-virus ^8, transposons BAC ^9, vecteurs épisomiques ^{10, 11} protéines ou de la livraison de l'ARN ^12. Bien que l'utilisation de méthodes de médiation virale peut conduire à l'hypertension reprogrammation de l'efficacité, des vecteurs viraux intégrer dans le génome des cellules hôtes et donc un potentiel mutagenèse par insertion aléatoire, altération permanente de l'expression génique, et la réactivation de transgènes au silence lors de la différenciation ne peut être exclue ^13.

Pour faire CSPi plus sûr pour la médecine régénérative, des efforts ont été faits pour tirer CSPi sans l'intégration de l'ADN exogène dans les génomes cellulaires. Bien que des vecteurs viraux et transposons soumis à accises ont été développés, il est encore difficile de savoir si courtes séquences du vecteur, qui restent inévitablement dans les cellules transduites après excision, et transposase expression, pourraient induire une altération dans la celluleparti- fonctionnent ^13. Malgré sa grande efficacité de reprogrammation, le virus Sendai représente une approche coûteuse et atteindre par-licence préoccupations avec la société qui a développé ce système ont le potentiel pour limiter son application dans les études translationnelles. En outre, la nécessité pour l'introduction directe de protéines et d'ARN nécessite la livraison multiple de reprogrammer des molécules avec les limitations techniques inhérentes Cela introduit, et l'efficacité globale de reprogrammation est très faible ^14. Il faut noter que les méthodes virales libres et non rentables intégration basée sur l'utilisation de plasmides épisomiques ont été rapportés avec succès pour la reprogrammation des fibroblastes de peau ^15. Plus précisément, dans le présent travail, nous avons décidé d'utiliser disponibles plasmides épisomiques gratuitement intégration commerciales, comme indiqué précédemment ^10,15.

À ce jour, les fibroblastes de la peau représentent la plus populaire type de cellule donneuse ^5. Cependant, d'autres sources de cellules ont été successfully reprogrammé en iPSCs y compris ¹⁶ des kératinocytes, des cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse, des cellules ¹⁷ stromales adipeuses ^{18, 19} follicules pileux et les cellules de pulpe dentaire ^20. L'isolement de ces cellules nécessite une intervention chirurgicale, et plusieurs semaines sont nécessaires pour l'expansion in vitro de cellules en vue d'établir une culture de cellules primaires.

Dans cette optique, la sélection de départ type de cellule est critique et il est tout aussi important d'être capable de produire des CSPi à partir de tissus facilement accessibles et moins invasifs tels que le sang. Les cellules mononucléaires de sang de cordon ^(21,22) de CBMNCs périphériques et les cellules mononucléées du sang ^(14,22-24) PBMNCs représentent des sources de cellules appropriés pour la dérivation de iPSCs.

Bien que l'efficacité de reprogrammation PBMNC adulte est de 20 à 50 fois inférieure à celle de CBMNCs ^22, ils restent le type cellulaire le plus commode à des fins d'échantillonnage. Dansfait, PBMNC échantillonnage présente l'avantage d'être très peu invasive, et en plus, ces cellules ne nécessitent pas une vaste extension des expériences in vitro avant de reprogrammation. À ce jour, différents protocoles ont rapporté que PBMNCs après la séparation de gradient de densité peuvent être congelés et décongelés jours à plusieurs mois après congélation et élargis pour quelques jours avant de reprogrammer en CSPi ^22,23. Néanmoins, dans la mesure où nous sommes conscients aucun rapports ont décrit une reprogrammation de PBMNCs de couches leucocytaires congelés. Surtout, buffy coats congelés prélevés sans séparation de gradient de densité représentent des échantillons de sang les plus courantes stockées dans les grandes biobanques à l'échelle des études de population, ce qui représente une piscine facilement accessible du matériel de production iPSC qui évite en outre la collecte d'échantillons.

Nous rapportons ici pour la première fois la génération de CSPi virales libres de couches leucocytaires humains congelés, basé sur un protocole décrit précédemment ^22. DansDe plus, ont été générées à partir de iPSCs PBMNCs congelés obtenus après séparation par gradient de densité, comme un protocole de commande pour les résultats de PBMNC gradient de densité non-purifiés.