Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van Frozen Buffy Coats behulp van niet-integrerende Episomaal plasmiden

In 2006 heeft de groep van Shinya Yamanaka ¹ aangetoond voor de eerste keer dat de somatische cellen van volwassen muizen en mensen kan worden omgezet in een pluripotente toestand door ectopische expressie van vier herprogrammering factoren (oktober-4, Sox-2, Klf-4, en c-Myc), genereert de zogenaamde geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) ^2. Patiëntspecifieke iPSCs lijken humane embryonale stamcellen (hESCs) qua morfologie, proliferatie en het vermogen om te differentiëren in de drie-kiem celtypen (mesoderm, endoderm en ectoderm), terwijl zonder de ethische bezwaren verbonden aan het gebruik van hESCs en bypassing mogelijke afstoting ^3. Aldus iPSCs weergegeven als een van de belangrijkste bronnen van patiënt-specifieke cellen voor basisonderzoek, drug screening, ziektemodel, evalueren van de toxiciteit en regeneratieve geneeskunde doeleinden ^4.

Verschillende benaderingen zijn gebruikt iPSC generatie virale integrerende vectoren⁽⁵ retrovirus, lentivirus ^6), niet-integrerende virale vectoren (adenovirus ^7), Sendai-virus ^8, BAC transposons ^9, episomale vectoren ^{10, 11} eiwitten of RNA delivery ^12. Hoewel het gebruik van virus-gemedieerde werkwijzen kunnen leiden tot hoge efficiency herprogrammering, virale vectoren integreren in het genoom van gastheercellen en daardoor potentiële willekeurige mutagenese kan permanente verandering van genexpressie en reactivering van zwijgen transgenen tijdens differentiatie niet uitgesloten ^13.

Om iPSCs veiliger regeneratieve geneeskunde maken, zijn pogingen gedaan om iPSCs afleiden zonder integratie van exogeen DNA in cellulair genoom. Hoewel accijnsgoederenverkeer virale vectoren en transposons zijn ontwikkeld, is nog onduidelijk of korte vectorsequenties, wat onvermijdelijk blijven de getransduceerde cellen na excisie en transposase expressie verandering in cel kan inducerenular functioneren ^13. Ondanks zijn hoge herprogrammering efficiëntie, Sendai virus vertegenwoordigt een dure aanpak en bereiken-door licenties zorgen met het bedrijf dat dit systeem ontwikkeld, het potentieel hebben om de toepassing ervan in translationeel onderzoek te beperken. Bovendien is de noodzaak om het monster direct van eiwitten en RNA vereist meerdere afgifte herprogrammeren moleculen met de inherente technische beperkingen dit brengt en herprogrammering algehele efficiëntie zeer laag ^14. Opmerkelijk zijn rendabel viraal-vrije en niet-integrerende methoden gebaseerd op het gebruik van episomale plasmiden met succes gerapporteerd voor de herschikking van huidfibroblasten ^15. Specifiek, in dit werk hebben we besloten om commercieel beschikbare integratie vrije episomale plasmiden gebruiken, zoals eerder gemeld ^10,15.

Tot op heden huidfibroblasten vormen de meest populaire donor celtype ^5. Echter, andere mobiele bronnen succes geweestalle codes opnieuw geprogrammeerd in iPSCs waaronder keratinocyten ^16, beenmerg mesenchymale stamcellen ^17, stromacellen in vetweefsel ^18, haarzakjes ^19, en tandheelkundige pulp cellen ^20. De isolatie van deze cellen vereist chirurgische procedures, en enkele weken nodig om in vitro celexpansie om een primaire celkweek stellen.

In dit licht is de keuze van het starten celtype is kritisch en is het even belangrijk om te kunnen iPSCs produceren van gemakkelijk toegankelijke en minder invasief weefsels zoals bloed. Zowel navelstrengbloed mononucleaire cellen (CBMNCs) ^21,22 en perifere bloed mononucleaire cellen (PBMNCs) ^14,22-24 vertegenwoordigen geschikte bron van cellen voor de afleiding van iPSCs.

Hoewel de efficiëntie van volwassen PBMNC herprogrammering 20-50 keer lager dan die van CBMNCs ^22, blijven ze de meest geschikte celtype voor bemonstering doel. InEigenlijk PBMNC bemonstering heeft het voordeel dat minimaal invasief, en bovendien zijn deze cellen niet uitgebreid in vitro expansie voor herprogrammering experimenten vereist. Tot nu toe zijn verschillende protocollen gemeld dat PBMNCs na dichtheidsgradiënt scheiding kan worden ingevroren en ontdooid dagen tot enkele maanden na invriezen en uitgebreid voor enkele dagen vóór herprogrammeren in iPSCs ^22,23. Echter zover wij weten geen rapporten herprogrammering van PBMNCs uit bevroren buffy coats beschreven. Belangrijk is bevroren buffycoats verzameld zonder dichtheidsgradiënt scheiding vertegenwoordigen de meest voorkomende bloedstalen opgeslagen in grootschalige biobanken van de bevolking studies, dus neerkomt op een gemakkelijk toegankelijke pool van materiaal voor iPSC productie die verder monstername voorkomt.

Hierin beschrijven we voor het eerst de productie van virale-vrij iPSCs uit humane bevroren buffy coats, gebaseerd op een eerder beschreven protocol ^22. InDaarnaast werden iPSCs geproduceerd uit bevroren PBMNCs verkregen na dichtheidsgradiënt scheiding als een controleprotocol voor non-density gradient gezuiverde PBMNC resultaten.