جيل من المستحثة متعددة القدرات الخلايا الجذعية من المجمدة بافي معاطف استخدام غير دمج-Episomal البلازميدات
Summary
الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) تمثل مصدرا للأنسجة المريض محددة للتطبيقات السريرية والبحوث الأساسية. هنا، نقدم بروتوكول مفصلة لإعادة برمجة الخلايا البشرية الطرفية وحيدة النواة في الدم (PBMNCs) تم الحصول عليها من المعاطف الشهباء المجمدة في iPSCs مجانا الفيروسية باستخدام غير دمج-البلازميدات episomal.
Abstract
الخلايا الجسدية يمكن برمجتها إلى يسببها الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) عن طريق إجبار التعبير عن أربعة عوامل النسخ (أكتوبر-4، سوكس-2، KLF-4، ج. Myc على)، عن عادة عن طريق الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) . نظرا لتشابهها مع hESCs، أصبحت iPSCs أداة هامة لالمحتملين الطب المريض محددة على التجدد، وتجنب القضايا الأخلاقية المرتبطة hESCs. من أجل الحصول على خلايا مناسبة لتطبيق السريرية، تحتاج iPSCs خالية من التحوير أن تتولد لتجنب تنشيط التحوير، تغير التعبير الجيني والتمايز المضلل. وعلاوة على ذلك، وهي طريقة ذات كفاءة عالية وغير مكلفة برمجة ضروري لاشتقاق iPSCs كافية لأغراض علاجية. ونظرا لهذه الحاجة، وهو نهج عدم دمج episomal البلازميد الكفاءة هو الخيار الأفضل لالتوجيهية الاشتقاق. حاليا نوع من الخلايا الأكثر شيوعا تستخدم لأغراض إعادة برمجة الخلايا الليفية و، وعزل الأمر الذي يتطلب أخذ عينة الأنسجة، وأناإجراء العمليات الجراحية nvasive للمريض. وبالتالي، يمثل الدم المحيطي البشري الأنسجة التي يمكن الوصول إليها والأقل الغازية لتوليد التوجيهية.
في هذه الدراسة، وتفيد التقارير بروتوكول مجانا الفيروسية فعالة من حيث التكلفة واستخدام غير دمج-البلازميدات episomal لتوليد iPSCs من خلايا الإنسان الطرفية وحيدة النواة في الدم (PBMNCs) تم الحصول عليها من المعاطف الشهباء المجمدة بعد الطرد المركزي كله دم وبدون كثافة الفصل الانحدار.
Introduction
في عام 2006، وشينيا ياماناكا مجموعة من 1 أثبتت لأول مرة أن الخلايا الجسدية من الفئران والبشر البالغين يمكن تحويلها إلى دولة المحفزة التي كتبها التعبير خارج الرحم من أربعة عوامل إعادة برمجة (أكتوبر-4، سوكس-2، KLF-4، و ج. Myc على)، وتوليد ما يسمى الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) 2. iPSCs المريض محددة تشبه الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) من حيث التشكل والانتشار والقدرة على التمايز إلى أنواع الخلايا الجرثومية الثلاث (الأديم المتوسط، الأديم والأديم الظاهر)، في حين تفتقر إلى المخاوف الأخلاقية المرتبطة باستخدام hESCs وتجاوز من الممكن الرفض المناعي 3. وبالتالي، iPSCs تبدو وكأنها واحدة من أهم مصادر خلايا المريض محددة للبحوث الأساسية، وفحص المخدرات، والنمذجة المرض، وتقييم سمية، وأغراض الطب التجديدي 4.
وقد استخدمت عدة طرق لتوليد التوجيهية: ناقلات دمج الفيروسية(الارتجاعي 5، الفيروسة البطيئة 6)، الفيروسي عدم دمج نواقل (اتش 7)، سينداي الفيروسات 8 والترانسبوزونات BAC 9 ناقلات episomal 10، 11 البروتينات أو تسليم RNA 12. على الرغم من أن استخدام وسائل بوساطة الفيروس يمكن أن يؤدي إلى ارتفاع كفاءة برمجة، ناقلات فيروسية على الاندماج في جينوم الخلية المصابة، وبالتالي المحتملة الطفرات إقحامي عشوائية، تغيير دائم في التعبير الجيني، وتنشيط الجينات المحورة إسكات خلال التمايز لا يمكن استبعاد 13.
لجعل iPSCs أكثر أمانا للطب التجديدي، بذلت جهود لاستخلاص iPSCs دون دمج الحمض النووي الخارجية في الجينوم الخلوي. على الرغم من النواقل والترانسبوزونات الفيروسية خاضع للضريبة وضعت، فإنه لا يزال من غير الواضح ما إذا كان تسلسل ناقلات القصيرة، التي لا تزال حتما في الخلايا transduced بعد الختان، وtransposase التعبير، يمكن أن يفضي التغيير في الخليةجزيئية يعمل 13. على الرغم من ارتفاع كفاءة إعادة برمجة لها، ويمثل فيروس سينداي نهج مكلفة والوصول من خلال المخاوف الترخيص مع الشركة التي طورت هذا النظام لديها القدرة على الحد من تطبيقه في الدراسات متعدية. وعلاوة على ذلك، فإن الحاجة إلى إدخال المباشر من البروتينات والحمض النووي الريبي يتطلب تسليم متعددة من إعادة برمجة الجزيئات مع القيود التقنية المتأصلة هذا يدخل، وكفاءة إعادة برمجة الشاملة منخفضة جدا (14). من المذكرة، تم الإبلاغ عن أساليب الحرة الفيروسية وعدم دمج فعالة من حيث التكلفة على أساس استخدام البلازميدات episomal بنجاح لإعادة برمجة الخلايا الليفية الجلد 15. على وجه التحديد، في العمل الحالي قررنا استخدام التجارية المتاحة البلازميدات episomal خالية من التكامل، كما ذكرت سابقا 10،15.
حتى الآن، الخلايا الليفية الجلدية تمثل الأكثر شعبية نوع من الخلايا المانحة 5. ومع ذلك، فإن مصادر أخرى من الخلايا نجاح للبرمجتها sfully إلى iPSCs بما في ذلك الخلايا الكيراتينية 16، نخاع العظم الخلايا الجذعية الوسيطة 17، خلايا انسجة الدهنية 18، 19 بصيلات الشعر، وخلايا لب الأسنان 20. عزل هذه الخلايا تتطلب عمليات جراحية، وهناك حاجة لعدة أسابيع لفي المختبر توسيع الخلية من أجل تأسيس ثقافة الخلية الأولية.
في ضوء ذلك، واختيار لبدء نوع من الخلايا أمر بالغ الأهمية، وأنه من المهم أيضا أن تكون قادرة على إنتاج iPSCs من الأنسجة يمكن الوصول إليها بسهولة وأقل الغازية مثل الدم. كل من الخلايا وحيدة النواة دم الحبل السري (CBMNCs) 21،22 والطرفية وحيدة النواة خلايا الدم (PBMNCs) 14،22-24 تمثل المصادر المناسبة من الخلايا للاشتقاق iPSCs.
على الرغم من أن كفاءة الكبار PBMNC إعادة برمجة أقل 20-50 مرات من تلك التي من CBMNCs 22، إلا أنها تظل نوع من الخلايا الأكثر ملاءمة لغرض أخذ العينات. فيالواقع، PBMNC أخذ العينات لديها ميزة كونها الغازية الحد الأدنى، وبالإضافة إلى ذلك، وهذه الخلايا لا تتطلب توسيع نطاق واسع في المختبر قبل إعادة برمجة التجارب. حتى الآن، وأفادت البروتوكولات المختلفة التي PBMNCs بعد الانفصال كثافة التدرج يمكن تجميد وإذابة أيام إلى عدة أشهر بعد تجميد وتوسيع نطاقها لبضعة أيام قبل إعادة برمجة إلى iPSCs 22،23. ومع ذلك، بقدر ما نحن ندرك ووصف أي تقارير عن إعادة برمجة PBMNCs من المعاطف الشهباء المجمدة. الأهم من ذلك، المعاطف الشهباء المجمدة التي تم جمعها من دون فصل كثافة التدرج تمثل عينات الدم الأكثر شيوعا المخزنة في المصارف البيولوجية على نطاق واسع من الدراسات السكانية، مما يمثل حمام سباحة يمكن الوصول إليه بسهولة من المواد اللازمة لإنتاج التوجيهية أن يتجنب المزيد من جمع العينات.
هنا نقدم تقريرا للمرة الأولى توليد iPSCs مجانا الفيروسية من الإنسان المعاطف الشهباء المجمدة، استنادا إلى البروتوكول هو موضح سابقا (22). فيبالإضافة إلى ذلك، تم إنشاء iPSCs من PBMNCs المجمدة التي تم الحصول عليها بعد الانفصال كثافة التدرج، وبروتوكول التحكم في نتائج PBMNC غير الكثافة التدرج تنقيته.
Protocol
Representative Results
Discussion
في الماضي، والطريقة الوحيدة للحصول على الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان يحمل طفرة جينية معينة كان لتجنيد الآباء تمر قبل الزرع التشخيص الوراثي وتوليد خلايا جذعية جنينية من الكيسات الأريمية على التخلص 31،32. باستخدام نهج برمجة، يمكن للباحثين الآن تولد iPSCs من المر?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The study was supported by the Ministry of Health and Department of Educational Assistance, University and Research of the Autonomous Province of Bolzano and the South Tyrolean Sparkasse Foundation.
Materials
| Sodium Citrate buffered Venosafe Plastic Tube | Terumo | VF-054SBCS07 | |
| Ammodium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Potassium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 60339 | |
| EDTA disodium powder | Sigma-Aldrich | E5134 | 0.5 M solution |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare Life Sciences | 17-5442-02 | Polysucrose solution for density gradient centrifugation |
| Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) | Gibco | 21056-023 | No phenol red |
| Ham's F-12 | Mediatech | 10-080-CV | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS -X) | Gibco | 51500-056 | 1X (Stock: 100X) |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Gibco | 11905031 | 1X (Stock: 100X) |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | Final Concentration at 200 µM |
| Recombinant Human Stem Cell Factor (SCF) | PeproTech | 300-07 | 100 ng/ml (Stock:100 µg/ml) |
| Recombinant Human Interleukin-3 (IL-3) | PeproTech | 200-03 | 10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml) |
| Recombinant Human Insulin-like Growth Factor (IGF-1) | PeproTech | 100-11 | 40 ng/ml (Stock: 40 µg/ml) |
| Recombinant Human Erythropoietin (EPO) | R&D Systems | 287-TC-500 | 2 U/ml (Stock: 50 U/ml) |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915 | 1 μM (Stock: 1 mM) |
| Human Holo-Transferrin | R&D Systems | 2914-HT | 100 μg/ml (Stock: 20 mg/ml) |
| Amniomax II | Gibco | 11269016 | Medium for cytogenetic analysis |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 5850 | Medium for iPSC feeder-free culture |
| Knockout DMEM | Gibco | 10829-018 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030-024 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140-050 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | 0.1 mM (Stock: 50 mM) |
| Sodium Butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | 0.25 mM (Stock: 0.5 M) |
| Recombinant Human FGF basic, 145 aa | R&D Systems | 4114-TC | 10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml) |
| Y-27632 dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503 | 10 µM (Stock: 10 mM) |
| Fetal Defined Bovine Serum | Hyclone | SH 30070.03 | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Merck-Millipore | ES-006-B | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced | BD Biosciences | 354230 | |
| Collagenase, Type IV | Gibco | 17104-019 | 1 mg/ml (Stock: 10 mg/ml) |
| Accutase | PAA Laboratories GmbH | L11-007 | Cell detachment solution |
| Mouse Embryonic Fibroblast (CF1) | Global Stem | GSC-6201G | 1*106 cells/6 well plate |
| Plasmid pCXLE-hOCT3/4-shp53-F | Addgene | 27077 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Plasmid pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Plasmid pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Plasmid pCXLE-EGFP | Addgene | 27082 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Alkaline Phosphatase Staining Kit | Stemgent | 00-0009 | |
| Anti-Stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4) Antibody | Merck-Millipore | MAB4304 | 1/250 |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Merck-Millipore | MAB4360 | 1/250 |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Merck-Millipore | MAB4381 | 1/250 |
| Anti-Oct-3/4 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-9081 | 1/500 |
| Anti-Nanog Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-33759 | 1/500 |
| Anti-Troponin I Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-15368 | 1/500 |
| Anti-α-Actinin (Sarcomeric) Antibody | Sigma-Aldrich | A7732 | 1/250 |
| Neuronal Class III ß-Tubulin (TUJ1) Antibody | Covance Research Products Inc | MMS-435P-100 | 1/500 |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody | Calbiochem | 657012 | 1/200 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse | Molecular Probes | A-11029 | 1/1000 |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Rabbit | Molecular Probes | A-21429 | 1/1000 |
| Ultra-Low Attachment Cell Culture 6-well plate | Corning | 3471 | |
| Trizol Reagent | Ambion | 15596-018 | reagent for RNA extraction |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11754050 | Reverse transcriptase kit |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5124 | |
| CFX96 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 185-5195 | |
| Experion Automated Electrophoresis System | Bio-Rad | 700-7000 | Instrument to check RNA integrity |
| Experion RNA Highsense Analysis kit | Bio-Rad | 7007105 | Reagent kit to check RNA integrity |
| Dissecting microscope (SteREO Discovery V12 ) | Zeiss | 495007 | |
| NeonTransfection System 100 µL Kit | Invitrogen | MPK10025 | Reagent kit for electroporation |
| Neon Transfection System | Invitrogen | MPK5000 | Instrument used for electroporation |
| NanoDrop UV/Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | Instrument for DNA/RNA quantification |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid purification kit |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat. Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).
- Drews, K., Jozefczuk, J., Prigione, A., Adjaye, J. Human induced pluripotent stem cells–from mechanisms to clinical applications. J. Mol. Med. (Berl). 90 (7), 735-745 (2012).
- Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells). Curr. Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Sommer, A. G., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector. J. Vis. Exp. (68), e4327 (2012).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
- Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).
- Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat. Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell. Stem Cell. 4 (6), 472-476 (2009).
- Warren, L., Ni, Y., Wang, J., Guo, X. Feeder-free derivation of human induced pluripotent stem cells with messenger RNA. Sci. Rep. 2, 657 (2012).
- Stadtfeld, M., Hochedlinger, K. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. Genes Dev. 24 (20), 2239-2263 (2010).
- Chou, B. K., et al. Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures. Cell Res. 21 (3), 518-529 (2011).
- Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat. Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).
- Streckfuss-Bomeke, K., et al. Comparative study of human-induced pluripotent stem cells derived from bone marrow cells, hair keratinocytes, and skin fibroblasts. Eur. Heart J. 34 (33), 2618-2629 (2013).
- Miyoshi, N., et al. Reprogramming of mouse and human cells to pluripotency using mature microRNAs. Cell. Stem Cell. 8 (6), 633-638 (2011).
- Wang, Y., et al. Induced pluripotent stem cells from human hair follicle mesenchymal stem cells. Stem Cell. Rev. 9 (4), 451-460 (2013).
- Beltrao-Braga, P. C., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from human immature dental pulp stem cells. Cell Transplant. 20 (11-12), 1707-1719 (2011).
- Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell. Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
- Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nat. Protoc. 7 (11), 2013-2021 (2012).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell. Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
- Geti, I., et al. A practical and efficient cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells from adults: blood-derived endothelial progenitor cells. Stem Cells Transl. Med. 1 (12), 855-865 (2012).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. , Appendix 3-Appendix 3B (2001).
- Hasegawa, K., et al. Comparison of reprogramming efficiency between transduction of reprogramming factors, cell-cell fusion, and cytoplast fusion. Stem Cells. 28 (8), 1338-1348 (2010).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), 2565 (2010).
- Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Mol Aspects Med. 27 (2-3), 126-129 (2006).
- Meraviglia, V., et al. Human chorionic villus mesenchymal stromal cells reveal strong endothelial conversion properties. Differentiation. 83 (5), 260-270 (2012).
- Caspersson, T., Zech, L., Johansson, C. Analysis of human metaphase chromosome set by aid of DNA-binding fluorescent agents. Exp Cell Res. 253 (2), 302-304 (1999).
- Alikani, M., Munne, S. Nonviable human pre-implantation embryos as a source of stem cells for research and potential therapy. Stem Cell. Rev. 1 (4), 337-343 (2005).
- Tropel, P., et al. High-efficiency derivation of human embryonic stem cell lines following pre-implantation genetic diagnosis. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 46 (3-4), 376-385 (2010).
- Hanna, J., et al. Direct cell reprogramming is a stochastic process amenable to acceleration. Nature. 462 (72-73), 595-601 (2009).
- Li, H., et al. The Ink4/Arf locus is a barrier for iPS cell reprogramming. Nature. 460 (7259), 1136-1139 (2009).
- Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
- Lindner, S. E., Sugden, B. The plasmid replicon of Epstein-Barr virus: mechanistic insights into efficient, licensed, extrachromosomal replication in human cells. Plasmid. 58 (1), 1-12 (2007).
