בידוד של לויקוציטים מרקמות Murine בממשק האם והעובר

סובלנות חיסונית בהריון היא תקופה בה שינויים ייחודיים להתרחש בתוך המערכת החיסונית של האם. שינויים אלו מאפשרים לאם לעובר תסבול, שתל למחצה אלוגנאית ^1. העובר מבטא מורכב histocompatibility גדול אבהי (MHC) אנטיגנים ^2, ותאים עובריים כבר נמצאו במחזור הדם האימהי ^3; עם זאת, העובר לא נדחה ^4,5. חידה זה לא מובן לחלוטין.

ההשערה האחרונה קובע כי סובלנות אימהית-עוברית נוצר במהלך משגל והפרית ^6,7 ומתוחזק כדי לקיים הריון טווח מלא ^8-10. פירוט של סובלנות אימהית-עוברי זה נחשב מנגנון של מחלה במהלך הריון ^10-16 המוקדם ומאוחר שלבים. סובלנות האם ועובר כרוך בהשתתפות תת-אוכלוסיות לויקוציטים שונות, כוללים תאי T (תאי T רגולטורים, תאי Th1, תאי Th2, ותאי TH17), מקrophages, נויטרופילים, תאי פיטום, תאי NK, ותאי NKT, תאים דנדריטים, ותאי B, ששינוי בצפיפות ולוקליזציה במהלך הריון ^15,17-19. סובלנות האם ועובר מועשרת בממשק אימהי-העוברי ²⁰ – האתר אנטומיים בי המערכת החיסונית של האם אינטראקציה עם אנטיגנים העובריים ^20,21.

הממשק אימהי-העוברי נוצר במהלך placentation כאשר תאי trophoblast extravillous העובריים לפלוש רירית רחם ^22-24. בצד העוברי של ממשק זה, הקרומים המקיפים את העובר ליצור משטח אפיתל מיוחד בתוך השליה, ותאי syncytiotrophoblast לשלוט בבורסה התזונתית באמצעות המגע הישיר שלהם עם דם אימהי ^22. בצד האימהי של הממשק, decidua מגייס בריכת הטרוגנית של לויקוציטים שבעכברים כ -30% עד 50% מכל תאי decidual. בנוסף להשתתפותם בmaternסובלנות חיסונית אל, תאים אלה הם תורמים מרכזיים לתהליכים שונים במהלך הריון, למשל., שליה ההגנה על מערכת הרבייה מזיהומים, הפריה, השרשת עובר ^7,25, אנגיוגנזה decidual ^26, שיפוץ כלי דם ^24,27, פלישת trophoblast ^28, פיתוח ^24,25, וסופו של דבר, עבודה ומסירה ^15,17. לכן, המחקר של לויקוציטים המעורב בסובלנות אימהית-עוברית הוא חיוני להבהרת פתוגנזה של סיבוכים הקשורים להריון.

בעוד שהשימוש באימונוהיסטוכימיה וimmunofluorescence יצר נתונים להדמיה הישירה והלוקליזציה של רחם, decidual, או כדוריות דם לבנות שליה ^29,30, cytometry זרימת הניתוח חשף נוסף תת ספציפי של לויקוציטים בכל אחד מרקמות אלה ^31,32. בנוסף, cytometry זרימה נעשה שימוש כדי לקבוע את הצפיפות וחלקם של מאטרסופי-עוברי ממשק לויקוציטים ³³ וביטוי רמות של חלבונים תאיים ו תאיים ^8-10,34. ניתוח תזרים cytometric של לויקוציטים בממשק אימהי-העוברי דורש השעיה תא בודד. כדי לבודד לויקוציטים מסתנן מdecidual, הרחם, ורקמות שליה, שתי שיטות של ניתוק רקמה שימשו: מכאנית והאנזימטית. שני השיטות לאפשר את ההפרדה של לויקוציטים הסתנן מהמטריצה ​​תאית (ECM) של רקמות אלה. ניתוק רקמה אנזימתי עדיף על ניתוק רקמה מכאני שכן היא מאפשרת תשואה גבוהה יותר של כדוריות דם לבנות עם הנזק קשור-כוח גזירה פחות ^35. כתוצאה מכך, ניתוק רקמה מכאני דורש איגום רקמות ^36, אשר עשוי להגדיל את השונות וההטרוגניות של הדגימות. עם זאת, ניתוק מכאני עשוי להיות הבחירה כאשר אנטיגן של עניין ניתן לשנות על ידי ניתוק האנזימטית או כאשר פונקציונלי של התאים של צורך העניין לשימור (לדוגמא., רעיל של תאי NK) ^35.

השימוש בproteolysis עם אנזימים ספציפיים לבזות ECM מבטל את התשואות נמוכות שנצפו עם ניתוק מכאני. מספר מחקרים דיווחו על השימוש בטריפסין ^32, collagenase ^{37, 31} DNase, dispase ^38, וקוקטיילים מסחריים של אנזימים שונים ^32,39. עם זאת, הטבע והריכוז של אנזימים שונים ואת משך הזמן של עיכול חייב להיות מוגדר בקפדנות ומאומתים על מנת להבטיח שמירה על שלמותו של אפיטופים אנטיגני פני תא הנדרשים לimmunophenotyping. מבני המשטח שונים באופן דיפרנציאלי רגישים להרס על ידי אנזימים שונים, עם כמה אנזימים, כגון טריפסין, להיות ידוע לשמצה בהפשטת epitopes משטח יקוציט מוכרת על ידי רבים נוגדנים חד-שבטיים.

הציג במסמך זה הוא שיטה באמצעות proteolytIC וקוקטייל האנזימטית collagenolytic, נקרא Accutase. פתרון האנזימטית זה עדין מספיק ועדיין יעיל במתנער רקמות עכברי בממשק האימהי-עוברי, ואינו דורש תוספת של חומרים כימיים מתנערים אחרים או סרום לסיים את תגובת הניתוק. יתר על כן, הוא מוכן לשימוש כפי שסופק ו, למרות שהזמן של ניתוק צריך להיות מאומת, זה יותר חזק מאשר האנזימים הנ"ל ^40,41.

הניצול של שילוב של שני הסוגים של רקמות disaggregation משפר את האיכות וכמות התאים שהושגו; כך, מספר מחקרים יישמו את השימוש בשילוב של ניתוק מכאני והאנזימטית עם תוצאות משביעות רצון ^31,32,37. הפרוטוקול המתואר במסמך זה הוקם ומאומתים במעבדה שלנו; היא משתמשת בשילוב של ניתוק מכאני עדין ואחריו disaggregation האנזימטית חזק. פרוטוקול זה מאפשר מחקר והבידוד נוסף שללויקוציטים מסתנן ברקמות עכברית בממשק האימהי-עוברי (רחם, decidua, ושליה). הפרוטוקול הבא גם שומר על השלמות של סמנים פני תא ותשואות מספיק תאי קיימא עבור יישומים במורד הזרם כפי שהודגם על ידי ניתוח התזרים cytometric. לבסוף, פרוטוקול זה שומר על העקביות של תא הכנה לניתוח והשוואה של רקמות עכברי שונות המרכיבות את הממשק אימהי-עוברי.