Isolierung von Leukozyten aus dem Mausgeweben an der Maternal-Fetal-Schnittstelle

Immuntoleranz bei Schwangerschaft ist eine Periode, in Scheidungs ​​Veränderungen im Immunsystem der Mutter erfolgen. Diese Änderungen ermöglichen die Mutter auf den Fötus, eine semi-allogenen Transplantats ¹ zu tolerieren. Der Fötus drückt väterlichen Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) -Antigene ² und fötalen Zellen im mütterlichen Kreislauf ³ gefunden worden ist; jedoch ist der Fötus nicht abgelehnt ^4,5. Dieses Rätsel ist nicht vollständig geklärt.

Die jüngste Hypothese besagt, dass Mutter und Fötus Toleranz während des Koitus erstellt und Befruchtung und ^6,7 gehalten, um eine volle Laufzeit der Schwangerschaft ^8-10 erhalten. Eine Aufschlüsselung dieser Mutter und Fötus Toleranz wird in der frühen und späten Stadien der Schwangerschaft ^10-16 als einen Mechanismus der Krankheit. Mutter und Fötus Toleranz beinhaltet die Mitwirkung der verschiedenen Leukozyten-Subpopulationen, einschließlich T-Zellen (regulatorische T-Zellen, Th1-Zellen, Th2-Zellen, und Th17-Zellen), macrophages, Neutrophilen, Mastzellen, NK-Zellen, NKT-Zellen, dendritische Zellen und B-Zellen, die Änderung in der Dichte und Lokalisierung während der Schwangerschaft ^15,17-19. Der anatomischen Stelle, wo das Immunsystem der Mutter mit den fetalen Antigene ^20,21 interagiert – Mutter und Fötus Toleranz wird am Mutter und Fötus-Schnittstelle ²⁰ angereichert.

Die Mutter und Fötus-Schnittstelle wird während des Plazenta erstellt, wenn die fetalen extravillösen Trophoblastenzellen dringen in die Uterusschleimhaut ^22-24. Auf der fetalen Seite dieser Schnittstelle, die Membranen den Fötus umgibt, schaffen eine spezialisierte Epitheloberfläche innerhalb der Plazenta und die Synzytiotrophoblasten Zellen steuern den Stoffaustausch durch ihre direkten Kontakt mit Blut der Mutter ^22. Auf der mütterlichen Seite der Schnittstelle, rekrutiert die decidua einen heterogenen Pool von Leukozyten, die bei Mäusen verantwortlich für 30% bis 50% aller Deciduazellen. Zusätzlich zu ihrer Beteiligung an Maternal Immuntoleranz, diese Zellen sind wichtige Mitwirkende zu verschiedenen Prozessen während der Schwangerschaft, z. B. der Schutz der reproduktiven Fläche von Infektionen, Befruchtung, Embryoimplantation ^7,25, dezidualen Angiogenese ^26, vaskuläre Remodeling ^24,27, Trophoblastinvasion ^28, Plazenta Entwicklungs ^24,25, und schließlich Arbeit und Lieferung ^15,17. Daher ist die Untersuchung der Leukozyten in Mutter und Fötus Toleranz beteiligt wichtig, die Aufklärung der Pathogenese von Schwangerschaftskomplikationen.

Während die Verwendung von Immunhistochemie und Immunfluoreszenz wurden Daten für die direkte Visualisierung und Lokalisierung von Gebärmutter-, decidual oder Plazenta Leukozyten ^29,30 erzeugt, Durchflusszytometrie-Analyse wurde weiterhin offenbart spezifische Untergruppen von Leukozyten, die in jedem dieser Gewebe ^31,32. Zusätzlich Durchflusszytometrie verwendet worden, um die Dichte und den Anteil von mater bestimmennal-fetalen Schnittstelle Leukozyten ³³ und Expression von extrazellulären und intrazellulären Proteinen ^8-10,34. Durchflusszytometrische Analyse von Leukozyten an der Mutter und Fötus-Schnittstelle benötigt eine Einzelzellsuspension. Um infiltrieren Leukozyten aus dem dezidualen, Gebärmutter und Plazenta-Gewebe zu isolieren, zwei Methoden der Gewebedissoziation verwendet: mechanische und enzymatische. Beide Verfahren ermöglichen die Trennung von infiltrierten Leukocyten aus der extrazellulären Matrix (ECM) dieser Gewebe. Enzymatische Gewebedissoziation überlegen ist mechanischen Gewebedissoziation, da es eine höhere Ausbeute an Leukozyten mit geringer Scherkraft-verbundenen Schäden ^35. Folglich mechanische Gewebedissoziation erfordert die Bündelung Gewebe ^36, das die Variabilität und Heterogenität der Proben erhöhen kann. Dennoch können mechanische Dissoziation der Wahl sein, wenn das Antigen von Interesse kann durch enzymatische Spaltung oder geändert werden, wenn die Funktionalität der Zelles von Interesse bewahrt werden müssen (z. B. Cytotoxizität von NK-Zellen) ^35.

Die Verwendung von Proteolyse mit spezifischen Enzymen, die ECM abbauen beseitigt die mechanische Dissoziation beobachtet geringe Ausbeuten. Mehrere Studien haben die Verwendung von Trypsin ^32, Collagenase ^37, DNase ^31, Dispase ³⁸ und kommerzielle Cocktails verschiedener Enzyme ^32,39 gemeldet. Jedoch muß die Art und Konzentration der verschiedenen Enzyme und die Dauer der Verdauung genau definiert und um zur Aufrechterhaltung der Integrität der Zelloberfläche antigene Epitope zur Immunphänotypisierung erforderlich sicherzustellen, validiert werden. Die verschiedenen Oberflächenstrukturen sind unterschiedlich anfällig für Zerstörung durch verschiedene Enzyme, mit einigen Enzymen, wie Trypsin, wobei berüchtigt Strippen von vielen monoklonalen Antikörpern erkannt Leukozyten Oberflächenepitope.

Hierin eingeführt ist ein Verfahren unter Verwendung eines proteolytic und kollagenolytische Enzymcocktail, genannt Accutase. Diese enzymatische Lösung ist sanft genug, während immer noch effizienter in distanziert Mausgeweben an der Mutter und Fötus-Schnittstelle und erfordert nicht die Zugabe von anderen distanziert Reagenzien oder Serum, die Dissoziation Reaktion zu beenden. Darüber hinaus ist es gebrauchsfertig geliefert zu bedienen und, obwohl die Zeit der Dissoziation Annahmen validiert werden soll, ist robuster als die oben erwähnten Enzyme, ^40,41.

Die Verwendung einer Kombination beider Arten von Gewebe-Disaggregation verbessert die Qualität und die Menge der Zellen erhalten wird; Daher haben mehrere Studien die kombinierte Verwendung von mechanischen und enzymatischen Spaltung mit befriedigenden Ergebnissen ^31,32,37 implementiert. Das hier beschriebene Protokoll wurde eingerichtet und in unserem Labor validiert; Es verwendet eine Kombination eines leichten mechanischen Dissoziation gefolgt von einem robusten enzymatische Zerlegung. Dieses Protokoll ermöglicht die Isolierung und die weitere Untersuchung vondie Infiltration von Leukozyten in Mausgeweben an der Mutter und Fötus-Schnittstelle (Uterus, Dezidua und Plazenta). Das folgende Protokoll unterhält auch die Integrität der Zelloberflächenmarker und Ausbeuten genügend lebensfähige Zellen für nachfolgende Anwendungen wie durch durchflusszytometrische Analyse demonstriert. Schließlich dieses Protokoll erhält die Konsistenz der Zellpräparation für die Analyse und den Vergleich von verschiedenen Mausgeweben zu komponieren die Mutter und Fötus-Schnittstelle.