Isolatie van leukocyten uit de Murine Tissues de Maternal-Fetal Interface

Immunotolerantie bij zwangerschap is een periode waarin kenmerkende reactie plaatsvinden het immuunsysteem van de moeder. Deze veranderingen kan de moeder naar de foetus, een semi-allogeen transplantaat ¹ tolereren. De foetus tot expressie vaderlijke major histocompatibility complex (MHC) antigenen ² en foetale cellen gevonden in de moederlijke circulatie ^3; echter de foetus niet verworpen ^4,5. Dit raadsel is niet helemaal duidelijk.

De meest recente hypothese stelt dat de moeder-foetale tolerantie wordt gemaakt tijdens de coïtus en bevruchting ^6,7 en onderhouden om een voldragen zwangerschap ^8-10 ondersteunen. Een uitsplitsing van deze moeder-foetale tolerantie wordt beschouwd als een mechanisme van de ziekte tijdens de vroege en late stadia van de zwangerschap ^10-16. Maternale-foetale tolerantie betreft de deelname van diverse leukocyten subpopulaties, waaronder T-cellen (regulatoire T-cellen, Th1-cellen, Th2-cellen, en Th17 cellen), macrophages, neutrofielen, mastcellen, NK-cellen en NKT-cellen, dendritische cellen en B-cellen, die verandering in dichtheid en lokalisatie gedurende de zwangerschap ^15,17-19. Maternale-foetale tolerantie verrijkt ten maternale-foetale-interface ²⁰ – de anatomische plaats waar het immuunsysteem van de moeder interageert met de foetale antigenen ^20,21.

De moeder-foetale interface is gemaakt tijdens placentatie wanneer de foetale extravilleuze trofoblastcellen binnenvallen de baarmoeder slijmvlies ^22-24. Aan de foetale kant van deze interface, de vliezen rond de foetus het creëren van een gespecialiseerde epitheeloppervlak binnen de placenta en de syncytiotrofoblast cellen controle van de uitwisseling van voedingsstoffen via hun direct contact met bloed van de moeder ^22. Aan moederszijde van de interface, de decidua rekruteert heterogene pool van leukocyten in muizen die verantwoordelijk zijn voor 30% tot 50% van alle decidua cellen. Naast hun deelname aan Maternal immuun tolerantie, deze cellen zijn de belangrijkste bijdragers aan verschillende processen tijdens de zwangerschap, bijv., de bescherming van de voortplantingsorganen van infecties, bevruchting, embryo implantatie ^7,25, deciduale angiogenese ^26, vasculaire remodeling ^24,27, trofoblastinvasie ^28, placenta ontwikkeling ^24,25, en, uiteindelijk, arbeid en levering ^15,17. Daarom is het onderzoek van de bij maternale-foetale tolerantie leukocyten is essentieel voor het ophelderen van de pathogenese van zwangerschap gerelateerde complicaties.

Hoewel het gebruik van immunohistochemie en immunofluorescentie gegevens heeft gegenereerd voor de directe visualisatie en lokalisatie van baarmoeder, decidua of placenta leukocyten ^29,30 flowcytometrie analyse bleek voorts specifieke subsets van leukocyten in elk van deze weefsels ^31,32. Daarnaast flowcytometrie is gebruikt om de dichtheid en percentage mater vastnal-foetale-interface leukocyten ³³ en expressie van extracellulaire en intracellulaire eiwitten ^8-10,34. Flow cytometrische analyse van leukocyten bij de moeder-foetale-interface vereist een single-cell suspensie. Om infiltrerende leukocyten te isoleren van de deciduale, baarmoeder, placenta en weefsels zijn twee methoden weefsel dissociatie gebruikt: mechanische en enzymatische. Beide werkwijzen maken de scheiding van geïnfiltreerde leukocyten uit de extracellulaire matrix (ECM) van deze weefsels. Enzymatische weefsel dissociatie is superieur aan mechanische weefsel dissociatie omdat het zorgt voor een hogere opbrengst van leukocyten met minder shear-force-bijbehorende schade ^35. Bijgevolg mechanische weefsel dissociatie vraagt ​​erom weefsel ^36, waarbij de variabiliteit en heterogeniteit van de monsters kan toenemen. Toch kan mechanische dissociatie de keuze bij het antigeen van belang kan worden veranderd door enzymatische dissociatie of wanneer de functionaliteit van de cels plaats moeten worden behouden (bijv., cytotoxiciteit van NK-cellen) ^35.

De toepassing van proteolyse van specifieke enzymen om de ECM breken elimineert de lage opbrengsten waargenomen met mechanische dissociatie. Verschillende studies hebben melding gemaakt van het gebruik van trypsine ^32, collagenase ^37, DNase ^31, dispase ³⁸ en commerciële cocktails van verschillende enzymen ^32,39. Echter, de aard en concentratie van de verschillende enzymen en de duur van digestie nauwkeurig worden vastgesteld en gevalideerd om handhaving van de integriteit van het celoppervlak antigene epitopen vereist voor immunofenotypering waarborgen. De verschillende oppervlaktestructuren zijn differentieel gevoelig voor vernietiging door verschillende enzymen, met sommige enzymen, zoals trypsine, die bekend voor het strippen van leukocyten oppervlakte epitopen herkend door verschillende monoklonale antilichamen.

Hierin wordt geïntroduceerd is een methode waarbij een proteolytic en collagenolytische enzymatische cocktail, genaamd Accutase. Deze enzymatische oplossing is mild genoeg terwijl efficiënt dissociëren murine weefsels bij de maternale-foetale interface en vereist geen toevoeging van andere dissocieert reagentia of serum dat zij de dissociatie reactie te beëindigen. Bovendien is het klaar voor gebruik en behoeft, hoewel de tijd van dissociatie moet worden bevestigd, is robuuster dan de bovengenoemde enzymen ^40,41.

Het gebruik van een combinatie van beide soorten weefsel disaggregatie verbetert de kwaliteit en de hoeveelheid cellen verkregen; aldus, hebben verschillende studies het gecombineerde gebruik van mechanische en enzymatische dissociatie uitgevoerd met bevredigende resultaten ^31,32,37. De hierin beschreven protocol werd vastgesteld en gevalideerd in ons laboratorium; Het gebruikt een combinatie van een zachte mechanische dissociatie gevolgd door een sterke enzymatische uitsplitsing. Dit protocol maakt de isolatie en verdere studiede infiltrerende leukocyten in muizen weefsels bij de maternale-foetale interface (uterus, decidua en placenta). Het volgende protocol handhaaft de integriteit van celoppervlak markers en levert voldoende levensvatbare cellen voor verdere toepassingen zoals aangetoond door flow cytometrische analyse. Ten slotte is dit protocol handhaaft de samenhang van celpreparaat voor de analyse en vergelijking van verschillende murine weefsels van het maternale-foetale interface.