В пробирке и в естественных моделью для изучения бактериальной адгезии к стенке сосуда в проточных условиях
Summary
To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.
Abstract
Для того, чтобы вызвать эндоваскулярных инфекций и инфекционный эндокардит, бактерии должны быть способны прилипать к стенке сосуда, будучи подвержены напряжении сдвига течет кровь.
Для выявления бактериальных и хост факторов, которые способствуют сосудистой адгезии микроорганизмов, соответствующие модели, которые изучают эти взаимодействия в физиологических условиях сдвига необходимы. Здесь мы описываем в пробирке камеры модели потока, который позволяет исследовать бактериальную адгезию к различным компонентам внеклеточного матрикса или эндотелиальными клетками, и прижизненной микроскопии модель, которая была разработана непосредственно визуализировать начальную адгезию бактерий к висцеральной циркуляции в естественных условиях , Эти методы могут быть использованы для идентификации бактериальных и хост факторов, необходимых для адгезии бактерий в потоке. Проиллюстрируем актуальность напряжения сдвига и роль фактора фон Виллебранда для адгезии Staphylococcus стафилококк с использованием как в пробирке и в естественных условиях модели.
Introduction
To establish endovascular infections, pathogens require a mechanism to adhere to the endothelium, which lines the vessel wall and the inner surface of the heart, and to persist and establish an infection despite being exposed to the shear stress of rapidly flowing blood. The most frequent pathogen causing life-threatening endovascular infections and infective endocarditis is Staphylococcus aureus (S. aureus)1.
Various bacterial surface-bound adhesive molecules mediate adhesion to host tissue by interacting with extracellular matrix components. These MSCRAMMs (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules) recognize molecules such as fibronectin, fibrinogen, collagen and von Willebrand factor (VWF). MSCRAMMs are important virulence factors of S. aureus and are implicated in the colonization and invasion of the host2. Most studies on these virulence factors have been performed in static conditions, and thus may not be representative for human infections where initial adhesion of the bacteria occurs in flowing blood.
In the case of bloodstream infections, bacteria need to overcome the shearing forces of flowing blood in order to attach to the vessel wall. Models that investigate the interaction between bacteria and endothelium or subendothelium under flow conditions are therefore of particular interest.
A recent study showed that the adhesion of S. aureus to blood vessels under shear stress is mediated by VWF3. VWF, a shear stress-operational protein, is released from endothelial cells upon activation. Circulating VWF binds to collagen fibers of the exposed subendothelial matrix. Our group reported that the von Willebrand factor-binding protein (vWbp) of S. aureus is crucial for shear-mediated adhesion to VWF4.
In this article, we present an in vitro flow chamber model where bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells can be evaluated. To validate the findings from in vitro data, we have developed an in vivo model that visualizes and quantifies the direct interaction of bacteria with the vessel wall and the formation of bacteria-platelet thrombi in the mesenteric circulation of mice, using real-time intravital vascular microscopy.
Protocol
Representative Results
Discussion
Напряжение сдвига является решающим фактором для раннего бактериальной адгезии к стенке сосуда и последующего поколения эндоваскулярной или эндокардиальных растительности и метастатических инфекций 4,5. Мы описали дополняют друг друга в пробирке и в естественных условиях модели для изучения патогенеза эндоваскулярных инфекций при физиологической напряжения сдвига. Эти модели позволили определить фактор фон Виллебранда-связывающего белка (vWbp) в качестве основного S. стафилококк белка взаимодействуют в потоке с поврежденной сосудистой стенки подвергая ФВ 4.
Эндоваскулярные инфекции, и инфекционный эндокардит в частности, представляют интерес не только из-за сепсиса индуцированных органной недостаточности и смерти, но также из-за местных и дальних («») метастатических осложнений. Чтобы заставить инфекционный эндокардит и метастатических инфекций, бактерии должны придерживаться к стенке сосуда и, таким образом, противостоять напряжения сдвига в протекающей крови. Наиболееисследования факторов вирулентности бактерий были выполнены в статических условиях. Тем не менее, эти установленные взаимодействия не может выдержать силы сдвига и исследования в условиях потока может выявить новые, ранее неизвестные факторы бактерии-хозяина взаимодействия.
Использование камеры микро-параллельного течения, и мы, и другие показали важность ФВ для сосудов адгезии. Под напряжением сдвига, ФВ постепенно разворачивается от своего отдыха глобулярной структурой, и выставляет домен A1, который взаимодействует с тромбоцитами через его рецептором GPIb 6. Flow камеры были широко используются для изучения функции тромбоцитов 7.
Примечательно также С. стафилококк адгезии в потоке требуется VWF, и, в частности домен А1, что подвергается на сдвиг. Мы определили vWbp посредником связывание ФВ. vWbp является коагулазо, что способствует S. стафилококк патофизиологии путем активации протромбина хозяина. Staphylothrombin, что разрешенияulting комплекс бактериальной коагулазо и протромбина, превращает фибриноген в нерастворимый фибрин 8,9. Наши исследования показали, что vWbp не только активировать протромбин, но вызывает образование фибрина бактерии тромбоцитов агрегатов, которые увеличивают адгезию к кровеносных сосудов в потоке 4,10,11.
В пробирке камера модель потока позволяет изучать различные игроки в бактериальной адгезии к сотовым или матричных компонентов. Бактериальные факторы вирулентности могут быть изучены с помощью мутантов или безвредные бактерии, экспрессирующие специфические поверхностные белки. Кроме того, фармакологические ингибиторы или блокирующие антитела могут быть добавлены к среде в проточную камеру. Роль принимающих факторов, таких как различных компонентов внеклеточного матрикса могут быть изучены с помощью покровные с различными покрытиями. Покровные стекла могут быть также покрыты эндотелиальных клеток, из которых статус активации можно модулировать путем добавления конкретные стимуляторы. АпаRT из сосудистой стенки, вклад принимающих клеток крови и белков плазмы могут быть изучены путем добавления этих факторов в текучей среде. Таким образом, различные условия возрастающей сложности могут быть изучены в стандартных условиях ламинарного потока, чтобы разгадать взаимодействия, которые позволяют бактериям прилипать к стенке сосуда в естественных условиях.
Взаимодействия выявленные в модели в пробирке впоследствии учился в животной модели, чтобы проверить их актуальность в сложном организме. Другое в моделях естественных условиях для изучения динамического взаимодействия в потоке были описаны, например, в хомячка спинной кожной складки камеры 12 и кремастер модели 13. Для сравнения, брыжеечных модель перфузии описано здесь предлагает несколько преимуществ из-за своей простоты использования, возможность варьировать провести генетический фон мышей и оценить фармакологические вмешательства.
В заключение, описаны моделипредлагаем возможность для изучения поверхностных белков не только S. стафилококк, но и многих других микроорганизмов в разных слоев хозяев, чтобы лучше понять патогенез сосудистых инфекций.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Fonds пакета Wetenschappelijk Onderzoek (FWO) Vlaanderen G0466.10, 11I0113N; "Эдди Меркс Исследование Грант" и "Спорта исследования Грант" детской кардиологии, UZ Левен, Бельгия (x); Центр молекулярной биологии и сосудистой поддерживается Programmafinanciering KU Leuven (PF / 10/014), в "Geconcentreerde Onderzoeksacties" (ГОА) 2009/13 от университета Левена и исследовательский грант от компании Boehringer-Ingelheim.
Materials
| Brain Heart Infusion (BHI) | BD Plastipak | 237500 | |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Oxoid | CM0129 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Invitrogen | 14190-169 | D-PBS |
| 5(6)-carboxy-fluorescein N-hydroxysuccinimidyl ester | Sigma-Aldrich | 21878-25MG-F | fluorescent labeling |
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Roch | 10 735 086 001 | |
| Haemate-P | CSL Behring | PL 15036/0010 | VWF |
| Horm collagen | Takeda | 10500 | collagen |
| 1-well PCA cell culture chambers | Sarstedt | ######## | plastic slips |
| Temgesic | Reckitt Benckiser | 283716 | bruprenorphine |
| Anesketin (Ketamin hydrochloride 115 mg/ml (100 mg/ml ketaminum)) | Eurovet | BE-V136516 | ketamin |
| XYL-M 2% (xylazine hydrochloride 23.32 mg/ml (20 mg/ml xylazine)) | VMD Arendonk | BE-V170581 | xylazine |
| 2 french intravenous catheter green | Portex | 200/300/010 | |
| 0,9% Sodium chloride (NaCl) | Baxter Healthcare | W7124 | |
| cotton swabs | International Medical Product | 300230 | |
| Ca2+-ionophore solution A23187 | Sigma-Aldrich | C7522-10 MG | |
| 26 gauge 1 ml syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| 26 gauge 1 ml syringe with needle | BD Plastipak | 300015 | intra-peritoneal injection |
| Centrifuge 5810-R | Eppendorf | 5811 000.320 | |
| Glass cover slips (24×50) | VWR | BB02405A11 | Thickness No, 1 |
| PHD 2000 Infusion | Harvard Apparatus | 702100 | High-accuracy Harvard infusion pump |
| Axio-observer DI | Carl-Zeiss | Inverted fluorescence microscope | |
| ImageJ | National Institute of Health | Analysis software | |
| Graphpad Prism 5,0 | Graphpad Software | Analysis software | |
| AxioCam MRm | Carl-Zeiss | Black and white camera | |
References
- Vanassche, T., Peetermans, W. E., Herregods, M. C., Herijgers, P., Verhamme, P. Anti-thrombotic therapy in infective endocarditis. Expert Rev Cardiovasc Ther. 9 (9), 1203-1219 (2011).
- Heying, R., van de Gevel, J., Que, Y. A., Moreillon, P., Beekhuizen, H. Fibronectin-binding proteins and clumping factor A in Staphylococcus aureus experimental endocarditis: FnBPA is sufficient to activate human endothelial cells. Thromb Haemost. 97 (4), 617-626 (2007).
- Pappelbaum, K. I., et al. Ultralarge von Willebrand factor fibers mediate luminal Staphylococcus aureus adhesion to an intact endothelial cell layer under shear stress. Circulation. 128 (1), 50-59 (2013).
- Claes, J., et al. Adhesion of Staphylococcus aureus to the vessel wall under flow is mediated by von Willebrand factor–binding protein. Blood. 124 (10), 1669-1976 (2014).
- Thiene, G., Basso, C. Pathology and pathogenesis of infective endocarditis in native heart valves. Cardiovasc Pathol. 15 (5), 256-263 (2006).
- Sixma, J. J., Schiphorst, M. E., Verweij, C. L., Pannekoek, H. Effect of deletion of the A1 domain of von Willebrand factor on its binding to heparin, collagen and platelets in the presence of ristocetin. Eur J Biochem/FEBS. 196 (2), 369-375 (1991).
- Theilmeier, G., Lenaerts, T., Remacle, C., Collen, D., Vermylen, J., Hoylaerts, M. F. Circulating activated platelets assist THP-1 monocytoid/endothelial cell interaction under shear stress. Blood. 94 (8), 2725-2734 (1999).
- Bjerketorp, J., Jacobsson, K., Frykberg, L. The von Willebrand factor-binding protein (vWbp) of Staphylococcus aureus is a coagulase. FEMS Microbiol Lett. 234 (2), 309-314 (2004).
- Friedrich, R., et al. Staphylocoagulase is a prototype for the mechanism of cofactor-induced zymogen activation. Nature. 425 (6957), 535-539 (2003).
- Vanassche, T., et al. Fibrin formation by staphylothrombin facilitates Staphylococcus aureus-induced platelet aggregation. Thromb Haemost. 107 (6), 1107-1121 (2012).
- Vanassche, T., et al. The role of staphylothrombin-mediated fibrin deposition in catheter-related Staphylococcus aureus infections. J Infect Dis. 208 (1), 92-100 (2013).
- Buerkle, M. A., Lehrer, S., Sohn, H. Y., Conzen, P., Pohl, U., Krötz, F. Selective inhibition of cyclooxygenase-2 enhances platelet adhesion in hamster arterioles in vivo. Circulation. 110 (14), 2053-2059 (2004).
- Kim, K. H., Barazia, A., Cho, J. Real-time imaging of heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. J Vis Exp. 2 (74), (2013).
