in vitroおよびin vivoモデルでは血管壁の下でフローの状況に細菌付着を研究するために、

動物実験は、ルーヴェンカトリック大学の倫理委員会によって承認されました。 インビトロ灌流およびin vivo実験 1.準備細菌我々はSを使用しましたこの原稿に記載されているすべての実験のための黄色ブドウ球菌株ニューマン。S.黄色ブドウ球菌 Newmanのを-80℃で10％グリセロールにブレインハートインフュージョン（BHI）中に保存しました。 （3 OD 600>）、37℃でO / N凍結細菌を掻き落としおよび5に接種するために滅菌ループを使用mlのトリプシン大豆ブロス（TSB）。 遠心分離によって細菌を洗浄し（2600グラム、室温、5分）、5mlのPBS（リン酸緩衝生理食塩水）中に細菌ペレットを再懸濁します。 エタノール中の5（6） – カルボキシフルオレセインN-ヒドロキシエステル（カルボキシ – フルオレセイン）の1 mg / mlの溶液を調製します。実験室グレードの水で150μgの/ mlに1 mg / mlのカルボキシフルオレセイン溶液（ 例えば、ミリQ水）で希釈します。光からチューブを守ります-20℃でアルミ箔とストアと。 （2,600×gで、室温、5分）細菌を遠心します。 800μlのPBS中に細菌ペレットを再懸濁し、200μlまたは150 / mlのカルボキシ-フルオレセイン溶液を400μl（最終濃度in vivo実験のために50μg/ mlの）（灌流実験のための30μg/ mlの最終濃度）を追加します。アルミホイルで光からチューブを保護し、シェーカー上で室温で30分間インキュベートします。 標識後、PBS中に6％のウシ血清アルブミン（BSA）溶液でブロック。 光学密度測定を用いて細菌（OD）、OD in vitro実験のための0.65の600を希釈し（とOD インビボ実験のための1.8の600（約3×10 8コロニー形成単位（CFU） 黄色ブドウ球菌用/ mlに相当します） PBS中の黄色ブドウ球菌では約1×10 9 CFU / mlの）に対応します。アルミホイルで光からチューブを保護し、氷の上に残します。 2. インビトロ灌流実験ガラスカバースリップのコーティング実験室グレードの水でフォン·ヴィレブランド因子（VWF）（Haemate P、ストック濃度2,400μgの/ ml）に希釈し、50μg/ mlの最終濃度まで（蒸留脱イオン）。 160 / mlの最終濃度まで（製造業者によって供給されるSKF液、pHを2.7から2.9）、等張グルコース溶液中のコラーゲンを希釈。 パラフィルム上のコーティングの200μLを滴下し、液滴の上にカバースリップを置くことにより、VWFまたはコラーゲンでコートしたカバーガラス（24×50ミリメートル）。液滴は、カバーガラスの表面に沿って拡散します。 室温で4時間、加湿容器にカバースリップをインキュベートします。慎重に鈍い針でパラフィルムからカバーグラスを持ち上げます。フローチャンバーの底部にカバースリップをマウントします。 プラスチックのコーティングは、内皮細胞でスリップコー​​トプラスチックスリップPBS中の1％ゼラチン溶液1ml（1ウェルPCA細胞培養チャンバー、ザルスタット、ドイツ）を、37℃で30分間インキュベートします。ゼラチンコーティングされたプラスチック製のスリップ上シードヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）および70〜80％の密集度にそれらを成長させます。フローチャンバーの底部にあるプラスチック製のスリップをマウントします。 かん流実験注： インビトロ灌流モデルの概略図を図1に示されています。 異なる生理学的流れの条件をシミュレートするために2.5ダイン/ cm 2で20ダイン/ cm 2の間に層状剪断応力でマイクロ平行プレートフローチャンバーインビトロ細菌付着試験を行います。 フローチャンバー（社内の設計）は、金属フレーム及びプレキシガラスで作られた灌流チャンバー（ポリ（メチル）メタクリレート（PMMA））からなります。高精度の注入ポンプ（PHD 2000輸液、ハーバード装置、USA）に接続することによって、我々は、RAの流れを生成することができ0.0001マイクロリットル/分、220.82ミリリットル/分のTES。 フローチャンバーの上部にチューブを接続し、チューブに培地を注入します。静かに底部の上にフローチャンバの上部に配置し、フローチャンバーを組み立てます。気泡がないように注意してください。室内に漏れていないことを確認すると、過剰な塗布液を除去するために、チャンバを通って培地1mlを注入します。気泡を避けます。 顕微鏡トレイに37℃の熱制御加熱パッドの上にマウスを置きます。これは、端末の手順であるため、厳密な無菌の手順は必要ありません。頸静脈の近くの切開を行い、そっと子宮頸部筋肉の右側を削除し、周囲の組織から頸静脈を分離します。 輸液ポンプや蛍光顕微鏡を設定します。輸液ポンプの設定は、シリンジの直径と所望の流量（2.4節を参照）に依存しています。これからは、暗い部屋で働いています。 VWFコーティング： 蛍光標識された細菌と注射器を記入し、入口管に接続します。気泡を避けます。 10分間の注入ポンプを起動します。注入時間は、使用されるせん断速度およびコーティング、細菌やメディアに依存し、密着性の安定した状態を表している必要があります。 10分後、導入管にPBSで注射器を接続し、輸液ポンプを起動して、非結合細菌を洗い流します。 洗浄工程の後に異なる場所で少なくとも15画像​​や動画を取ります。細菌は小さく、集中することが潜在的に困難です。 インビトロ流動実験の前に、適切な焦点面をカバースリップ上で蛍光標識された細菌の滴を配置し、フローチャンバー内にカバースリップを配置することによって取得することができます。次に、適切な焦点面を検索し、設定を保存します。 注：in vitroでの流動実験中に、洗浄工程（開始後±5分）の間に画像を捕捉することだけを保証します付着細菌のための信号が捕捉されます。 コラーゲンコーティング： ただ灌流を開始する前に、蛍光標識された細菌に60 / mlののVWFを追加します。 60 / mlのVWFを補充した蛍光標識細菌または蛍光標識された細菌を注射器を記入し、入口管に接続します。気泡を避けます。繰り返しの手順は2.3.5.3に2.3.5.2 内皮細胞： のCa 2+ -ionophore A23187の0.1 mM溶液で灌流による内皮細胞を活性化して灌流によって10分間細菌灌流と同じせん断速度でDMEM中（ストック溶液をジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解した10mMの） 0.1 mMの。繰り返して、2.3.5.3に2.3.5.2を繰り返します。 次のようにせん断速度とせん断応力を計算します。 せん断速度= 6Q / WH 2 ：Q：流量W ml /分での速度、：センチ幅、H：cm単位の高させん断応力（τ）=せん断ラット元粘度（μ） どこμ：ミディアム：0.01ダインのx秒/ cm 2であり、全血：0.04ダインのx秒/ cm 2の 画像解析白黒カメラと倒立蛍光顕微鏡を使用してライブ画像を取得し、画像化ソフトウェアを使用して開発します。 1.5秒の露光時間を使用してください。ランダムフローチャンバーのコーティングされた表面上に広げ、適切なファイル形式で保存（少なくとも15）複数のスナップショットを取ります。 ImageJので画像解析を実行します。と関心のある特徴にグレースケール画像をセグメント化、下側および上側のしきい値を設定するしきい値を定義 – 画像（Substractバックグラウンド·プロセス）からのスムーズな連続バックグラウンドを除去するためのバックグラウンドを減算します。閾値に制限された領域を測定します。 細菌の付着を比較し、統計分析ソフトウェアを用いて、例えば 、蛍光領域として表さ。一方向ANOVAまたはTを使用してグループを比較しますWO-両側スチューデントt検定を。平均値の平均値±標準誤差（SEM）としてすべての値を報告します。重要な<0.05のp値を考えてみましょう（* P <0.05; ** P <0.01; *** P <0.001）。 インビボ腸間膜灌流モデル3. マウスの作製/手術便通を制限するために、実験前の夜、マウスを絶食。 ブプレノルフィンの皮下注射手術前に（0.1 mg / kg体重（BW））20〜30分まで6〜8週齢のマウス（C57BL / 6）手術前鎮痛を与えます。 ケタミンの腹腔内注射（125 / kg体重）およびキシラジン（12.5 / kg体重）で、マウスを麻酔。ペダル反射により確認してください。乾燥を防ぐために、獣医軟膏を適用します。 顕微鏡トレイに37℃の熱制御加熱パッドの上にマウスを置きます。これは、端末の手順であるので、厳密asceptiを必要としませんCプロシージャ。頸静脈の近くの切開を行い、そっと子宮頸部筋肉の右側を削除し、周囲の組織から頸静脈を分離します。 蛍光標識された細菌または他の溶液の注入のための右頸静脈に2フランス語静脈カテーテルを挿入します。腹部正中切開により腹腔を開き、腸間膜を広げるために綿棒を使用し、腸間膜動脈と細静脈循環を可視化します。 透明板の右側にマウスを置き、テープでカニューレを固定します。低体温症を防ぐためにホットパックを使用してください。組織の脱水を防ぐために、腸に500μlの0.9％のNaClをドロップします。 腸間膜循環への細菌付着の蛍光顕微鏡暗い部屋で働いています。船を固定し、倒立顕微鏡下でそれらを視覚化するために綿棒を使用してください。 局所的に10 mM溶液oの5μLを適用FのCa 2+ -ionophore A23187は、DMSOに溶解しました。 10秒後、頸静脈カテーテルを介して（ステップ1を参照）100μlの標識された細菌を注入します。タイムラプス画像を撮影します。実験が終了した後、機関承認ガイドラインに従ってマウスを安楽死させます。 画像解析倒立蛍光顕微鏡を使用してライブ画像を取得し、白黒カメラを用いて捕捉され、任意の画像処理ソフトウェアを使用して開発しました。自動露光時間と使用する機器に固有のコントラストの最適化を適用します。 千枚/秒の40サイクルを使用して – ツールバー（時間多次元買収）の「取得」ツールを使用してタイムラプス画像を取得します。適切な画像ファイル形式で画像を保存します。 画像あたりの蛍光シグナルの面積を測定するためにImageJの解析ソフトウェアを用いて処理画像。 Fにグレースケール画像をセグメント、下側及び上側のしきい値を設定するしきい値を定義します興味の特長。金利（血管）の領域を特定し、しきい値と関心領域に制限された領域を測定します。細菌の付着を比較し、いずれかの統計やグラフ作成ソフトウェアを使用して蛍光領域として表現。