במבחנת in vivo המודל ללמוד הידבקות חיידקים לכלי השיט וול תנאי זרימה תחת
Summary
To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.
Abstract
על מנת לגרום לזיהומי endovascular ואנדוקרדיטיס זיהומית, חיידקים צריכים להיות מסוגל לדבוק בקיר הכלי בעוד שנחשף ללחץ הגזירה של זורם דם.
כדי לזהות את גורמי חיידקים ומארח שתורמים להידבקות של כלי דם של מיקרואורגניזמים, מודלים מתאימים שללמוד אינטראקציות אלה בתנאים פיסיולוגיים גזירה יש צורך. כאן, אנו מתארים במבחנה מודל תא זרימה המאפשר לחקור הידבקות חיידקים לרכיבים שונים של מטריקס או לתאי אנדותל, ומודל מיקרוסקופיה intravital שפותח כדי לחזות ישירות ההידבקות הראשונית של חיידקים למחזור splanchnic in vivo . שיטות אלה יכולים לשמש כדי לזהות את גורמי חיידקים ומארח נדרשים להידבקות של חיידקים תחת זרימה. אנו ממחישים את הרלוונטיות של מאמץ גזירה ואת התפקיד של גורם פון Willebrand להידבקות של Staphylococcus aureus באמצעות שתי במבחנה ובמודל vivo.
Introduction
To establish endovascular infections, pathogens require a mechanism to adhere to the endothelium, which lines the vessel wall and the inner surface of the heart, and to persist and establish an infection despite being exposed to the shear stress of rapidly flowing blood. The most frequent pathogen causing life-threatening endovascular infections and infective endocarditis is Staphylococcus aureus (S. aureus)1.
Various bacterial surface-bound adhesive molecules mediate adhesion to host tissue by interacting with extracellular matrix components. These MSCRAMMs (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules) recognize molecules such as fibronectin, fibrinogen, collagen and von Willebrand factor (VWF). MSCRAMMs are important virulence factors of S. aureus and are implicated in the colonization and invasion of the host2. Most studies on these virulence factors have been performed in static conditions, and thus may not be representative for human infections where initial adhesion of the bacteria occurs in flowing blood.
In the case of bloodstream infections, bacteria need to overcome the shearing forces of flowing blood in order to attach to the vessel wall. Models that investigate the interaction between bacteria and endothelium or subendothelium under flow conditions are therefore of particular interest.
A recent study showed that the adhesion of S. aureus to blood vessels under shear stress is mediated by VWF3. VWF, a shear stress-operational protein, is released from endothelial cells upon activation. Circulating VWF binds to collagen fibers of the exposed subendothelial matrix. Our group reported that the von Willebrand factor-binding protein (vWbp) of S. aureus is crucial for shear-mediated adhesion to VWF4.
In this article, we present an in vitro flow chamber model where bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells can be evaluated. To validate the findings from in vitro data, we have developed an in vivo model that visualizes and quantifies the direct interaction of bacteria with the vessel wall and the formation of bacteria-platelet thrombi in the mesenteric circulation of mice, using real-time intravital vascular microscopy.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמץ גזירה הוא גורם מכריע להידבקות חיידקים מוקדם לקיר הכלי ועבור הדור הבא של endovascular או vegetations endocardial וזיהומים גרורתי 4,5. תארנו משלים במבחנה ובמודלי vivo ללמוד את הפתוגנזה של זיהומי endovascular תחת מאמץ גזירה פיסיולוגי. מודלים אלה אפשרו לנו לזהות חלבון פון Willebrand מחייב גורם (vWbp) כס המרכזי חלבון aureus לאינטראקציה תחת זרימה עם קיר כלי דם פגוע חושף VWF 4.
זיהומי Endovascular, ואנדוקרדיטיס זיהומית בפרט, הם דאגה לא רק בגלל כשל איברים מושרה אלח דם ומוות, אלא גם בגלל סיבוכים מקומיים ומרוחקים ("גרורתי"). לגרום לאנדוקרדיטיס זיהומית וזיהומים גרורתי, חיידקים יש לדבוק בקיר הכלי ובכך לעמוד בלחץ הגזירה של זורם דם. רובמחקרים על חיידקי גורמי אלימות בוצעו בתנאים סטטיים. עם זאת, אינטראקציות המבוססות אלה עלולים שלא לעמוד בכוחות ומחקרי גזירה תחת תנאי זרימה יכולה לחשוף גורמים חדשים, בלתי מוכרים בעבר ביחסי גומלין חיידקים-מארח.
שימוש בתא זרימת מיקרו-המקביל, אנחנו ואחרים הראינו את החשיבות של VWF להידבקות של כלי דם. תחת מאמץ גזירה, VWF הדרגה נפרשות מהמבנה הכדורי מנוחתו, וחושף את תחום A1 שאינטראקציה עם טסיות דם באמצעות קולט GPIB 6. תאי זרימה נעשו שימוש נרחב ללמוד לתפקד טסיות דם 7.
למרבה הפלא, גם ס הידבקות aureus תחת זרימה דורשת VWF, ובפרט תחום A1 שנחשף על גזירה. זיהינו vWbp לתווך VWF מחייב. vWbp הוא coagulase שתורם לס aureus הפתופיזיולוגיה ידי הפעלת פרותרומבין של המארח. Staphylothrombin, מילulting המורכב של coagulase ופרותרומבין חיידקים, ממיר את פיברינוגן לפיברין 8,9 מסיס. המחקרים שלנו הראו כי vWbp לא רק להפעיל פרותרומבין, אבל מפעיל את ההיווצרות של אגרגטים חיידקי הפיברין-טסיות, אשר משפרים את ההידבקות לכלי דם תחת זרימת 4,10,11.
במבחנה מודל תא הזרימה מאפשר ללמוד את השחקנים השונים בהידבקות חיידקים למרכיבים תאיים או מטריצה. ניתן ללמוד גורמים ארסי חיידקים באמצעות מוטציות או חיידקים מזיקים לבטא חלבוני משטח ספציפיים. לחלופין, ניתן להוסיף מעכבים תרופתיים או נוגדני חסימה למדיום בתא הזרימה. תפקידם של גורמי מארח כגון מרכיבים שונים של מטריקס ניתן ללמוד באמצעות coverslips עם ציפויים שונים. Coverslips גם יכול להיות מכוסה בתאי האנדותל, שמצב ההפעלה יכול להיות מווסת על ידי הוספה לגירוי ספציפי. APART מקיר כלי הדם, התרומה של תאי דם מארח וחלבוני פלזמה ניתן ללמוד על ידי הוספת הגורמים הללו למדיום זורם. לפיכך, תנאים שונים של מורכבות גוברים ניתן ללמוד בתנאים סטנדרטיים של זרימה למינרית לפענח את האינטראקציות המאפשרות לחיידקים להיצמד לקיר כלי in vivo.
אינטראקציות שזוהו במודל במבחנה הם למדו לאחר מכן במודל חיה כדי לבדוק את הרלוונטיות שלהם באורגניזם מורכב. אחר במודלי vivo ללמוד אינטראקציות דינמיות תחת זרימה תוארו, כגון תא גב אוגר skinfold 12 ומודל Cremaster 13. לשם השוואה, מודל זלוף mesenteric המתואר כאן מציע מספר יתרונות בגלל קלות שימוש, האפשרות ללהשתנות לארח רקע גנטי של העכברים ולהעריך התערבויות תרופתיות.
לסיכום, תאר דגמיםמציע את האפשרות ללמוד חלבונים לא רק של ס משטח aureus, אלא של רבים מיקרואורגניזמים אחרים ברקע מארח שונה, כדי להבין טוב יותר את הפתוגנזה של זיהומי כלי דם.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי חטיבות voor Wetenschappelijk Onderzoek (כשיש שתיים) Vlaanderen G0466.10, 11I0113N; "אדי מרקס מענק מחקר" ו" ספורטה המחקר גרנט "לקרדיולוגיה ילדים, UZ לובן, בלגיה (JC); המרכז לביולוגיה מולקולרית כלי דם נתמך על ידי Programmafinanciering KU Leuven (PF / 10/014), על ידי "Onderzoeksacties Geconcentreerde" (GOA 2009/13) מאוניברסיטת לובן ומענק מחקר מBoehringer Ingelheim-.
Materials
| Brain Heart Infusion (BHI) | BD Plastipak | 237500 | |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Oxoid | CM0129 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Invitrogen | 14190-169 | D-PBS |
| 5(6)-carboxy-fluorescein N-hydroxysuccinimidyl ester | Sigma-Aldrich | 21878-25MG-F | fluorescent labeling |
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Roch | 10 735 086 001 | |
| Haemate-P | CSL Behring | PL 15036/0010 | VWF |
| Horm collagen | Takeda | 10500 | collagen |
| 1-well PCA cell culture chambers | Sarstedt | ######## | plastic slips |
| Temgesic | Reckitt Benckiser | 283716 | bruprenorphine |
| Anesketin (Ketamin hydrochloride 115 mg/ml (100 mg/ml ketaminum)) | Eurovet | BE-V136516 | ketamin |
| XYL-M 2% (xylazine hydrochloride 23.32 mg/ml (20 mg/ml xylazine)) | VMD Arendonk | BE-V170581 | xylazine |
| 2 french intravenous catheter green | Portex | 200/300/010 | |
| 0,9% Sodium chloride (NaCl) | Baxter Healthcare | W7124 | |
| cotton swabs | International Medical Product | 300230 | |
| Ca2+-ionophore solution A23187 | Sigma-Aldrich | C7522-10 MG | |
| 26 gauge 1 ml syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| 26 gauge 1 ml syringe with needle | BD Plastipak | 300015 | intra-peritoneal injection |
| Centrifuge 5810-R | Eppendorf | 5811 000.320 | |
| Glass cover slips (24×50) | VWR | BB02405A11 | Thickness No, 1 |
| PHD 2000 Infusion | Harvard Apparatus | 702100 | High-accuracy Harvard infusion pump |
| Axio-observer DI | Carl-Zeiss | Inverted fluorescence microscope | |
| ImageJ | National Institute of Health | Analysis software | |
| Graphpad Prism 5,0 | Graphpad Software | Analysis software | |
| AxioCam MRm | Carl-Zeiss | Black and white camera | |
References
- Vanassche, T., Peetermans, W. E., Herregods, M. C., Herijgers, P., Verhamme, P. Anti-thrombotic therapy in infective endocarditis. Expert Rev Cardiovasc Ther. 9 (9), 1203-1219 (2011).
- Heying, R., van de Gevel, J., Que, Y. A., Moreillon, P., Beekhuizen, H. Fibronectin-binding proteins and clumping factor A in Staphylococcus aureus experimental endocarditis: FnBPA is sufficient to activate human endothelial cells. Thromb Haemost. 97 (4), 617-626 (2007).
- Pappelbaum, K. I., et al. Ultralarge von Willebrand factor fibers mediate luminal Staphylococcus aureus adhesion to an intact endothelial cell layer under shear stress. Circulation. 128 (1), 50-59 (2013).
- Claes, J., et al. Adhesion of Staphylococcus aureus to the vessel wall under flow is mediated by von Willebrand factor–binding protein. Blood. 124 (10), 1669-1976 (2014).
- Thiene, G., Basso, C. Pathology and pathogenesis of infective endocarditis in native heart valves. Cardiovasc Pathol. 15 (5), 256-263 (2006).
- Sixma, J. J., Schiphorst, M. E., Verweij, C. L., Pannekoek, H. Effect of deletion of the A1 domain of von Willebrand factor on its binding to heparin, collagen and platelets in the presence of ristocetin. Eur J Biochem/FEBS. 196 (2), 369-375 (1991).
- Theilmeier, G., Lenaerts, T., Remacle, C., Collen, D., Vermylen, J., Hoylaerts, M. F. Circulating activated platelets assist THP-1 monocytoid/endothelial cell interaction under shear stress. Blood. 94 (8), 2725-2734 (1999).
- Bjerketorp, J., Jacobsson, K., Frykberg, L. The von Willebrand factor-binding protein (vWbp) of Staphylococcus aureus is a coagulase. FEMS Microbiol Lett. 234 (2), 309-314 (2004).
- Friedrich, R., et al. Staphylocoagulase is a prototype for the mechanism of cofactor-induced zymogen activation. Nature. 425 (6957), 535-539 (2003).
- Vanassche, T., et al. Fibrin formation by staphylothrombin facilitates Staphylococcus aureus-induced platelet aggregation. Thromb Haemost. 107 (6), 1107-1121 (2012).
- Vanassche, T., et al. The role of staphylothrombin-mediated fibrin deposition in catheter-related Staphylococcus aureus infections. J Infect Dis. 208 (1), 92-100 (2013).
- Buerkle, M. A., Lehrer, S., Sohn, H. Y., Conzen, P., Pohl, U., Krötz, F. Selective inhibition of cyclooxygenase-2 enhances platelet adhesion in hamster arterioles in vivo. Circulation. 110 (14), 2053-2059 (2004).
- Kim, K. H., Barazia, A., Cho, J. Real-time imaging of heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. J Vis Exp. 2 (74), (2013).
