In vitro en in vivo model voor Bacteriële hechting aan de vaatwand Onder Flow omstandigheden te bestuderen
Summary
To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.
Abstract
Om endovasculair infecties en infectieuze endocarditis veroorzaken, moeten bacteriën kunnen hechten aan de vatwand terwijl blootstelling aan de afschuifspanning van stromend bloed.
Om de bacteriële en gastheer factoren die bijdragen tot vasculaire adhesie van micro-organismen te identificeren, worden de modellen die deze interacties onder fysiologische omstandigheden te bestuderen afschuiving nodig. Hier beschrijven we een in vitro flow chamber model waarmee bacteriële hechting onderzoeken in verschillende componenten van de extracellulaire matrix of endotheelcellen en een intravitale microscopie zoals dat is ontwikkeld om direct visualiseren de initiële hechting van bacteriën aan de splanchnische circulatie in vivo . Deze werkwijzen kunnen worden gebruikt om de bacteriële en gastheer factoren die nodig zijn voor de aanhechting van bacteriën onder stroming te identificeren. We illustreren het belang van de schuifspanning en de rol van von Willebrand factor voor de hechting van Staphyferment- aureus zowel met de in vitro en in vivo model.
Introduction
To establish endovascular infections, pathogens require a mechanism to adhere to the endothelium, which lines the vessel wall and the inner surface of the heart, and to persist and establish an infection despite being exposed to the shear stress of rapidly flowing blood. The most frequent pathogen causing life-threatening endovascular infections and infective endocarditis is Staphylococcus aureus (S. aureus)1.
Various bacterial surface-bound adhesive molecules mediate adhesion to host tissue by interacting with extracellular matrix components. These MSCRAMMs (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules) recognize molecules such as fibronectin, fibrinogen, collagen and von Willebrand factor (VWF). MSCRAMMs are important virulence factors of S. aureus and are implicated in the colonization and invasion of the host2. Most studies on these virulence factors have been performed in static conditions, and thus may not be representative for human infections where initial adhesion of the bacteria occurs in flowing blood.
In the case of bloodstream infections, bacteria need to overcome the shearing forces of flowing blood in order to attach to the vessel wall. Models that investigate the interaction between bacteria and endothelium or subendothelium under flow conditions are therefore of particular interest.
A recent study showed that the adhesion of S. aureus to blood vessels under shear stress is mediated by VWF3. VWF, a shear stress-operational protein, is released from endothelial cells upon activation. Circulating VWF binds to collagen fibers of the exposed subendothelial matrix. Our group reported that the von Willebrand factor-binding protein (vWbp) of S. aureus is crucial for shear-mediated adhesion to VWF4.
In this article, we present an in vitro flow chamber model where bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells can be evaluated. To validate the findings from in vitro data, we have developed an in vivo model that visualizes and quantifies the direct interaction of bacteria with the vessel wall and the formation of bacteria-platelet thrombi in the mesenteric circulation of mice, using real-time intravital vascular microscopy.
Protocol
Representative Results
Discussion
Shear stress is van cruciaal belang voor de vroege bacteriële hechting aan de vaatwand en de volgende generatie van endovasculaire of endocardiale vegetaties en metastatische infecties 4,5. We beschreven complementaire in vitro en in vivo modellen om de pathogenese van endovasculaire infecties onder fysiologische schuifspanning bestuderen. Deze modellen hebben ons aan von Willebrand-factor-bindend eiwit (vWbp) te identificeren als de belangrijkste S. aureus eiwit te communiceren onder stroom met een verwonde vaatwand bloot VWF 4.
Endovasculaire infecties en infectieuze endocarditis vooral van belang zijn, niet alleen vanwege sepsis geïnduceerde orgaanfalen en de dood, maar ook door lokale en verre (metastatisch) complicaties. Om infectieuze endocarditis en metastatische infecties veroorzaken, bacteriën moeten zich houden aan de vaatwand en dus verzetten tegen de shear stress van stromend bloed. Meeststudies op bacteriën virulentiefactoren zijn uitgevoerd in statische omstandigheden. Echter, deze gevestigde interacties misschien niet dwarskrachten en studies te weerstaan onder stroom omstandigheden kan nieuwe, voorheen onbekende factoren in bacterie-gastheer wisselwerking onthullen.
Met behulp van de micro-parallelle stroom kamer, hebben wij en anderen zien het belang van de VWF voor vasculaire adhesie. Onder shear stress, VWF geleidelijk ontvouwt uit zijn rustplaats bolvormige structuur, en onthult de A1 domein dat interageert met bloedplaatjes via de GPIb-receptor 6. Stroomkamers zijn uitgebreid gebruikt om bloedplaatjesfunctie 7 bestuderen.
Opmerkelijk is ook S. aureus hechting onder stroom vereist VWF, en in het bijzonder het A1 domein dat wordt blootgesteld aan afschuiving. We geïdentificeerd vWbp te bemiddelen VWF binding. vWbp is een coagulase die bijdraagt aan S. aureus pathofysiologie van protrombine de gastheer te activeren. Staphylothrombin, de resulting complex van een bacteriële coagulase en protrombine, zet fibrinogeen in onoplosbaar fibrine 8,9. Onze studies hebben aangetoond dat vWbp niet alleen geactiveerd prothrombine, maar leidt tot de vorming van bacterie-fibrine-aggregaten van bloedplaatjes, waardoor de hechting aan bloedvaten onder stroom 4,10,11 verbeteren.
De in vitro stromingskamer model maakt het mogelijk om de verschillende spelers in bacteriële hechting te bestuderen om cellulaire of matrix componenten. Bacteriële virulentie factoren kunnen worden bestudeerd met behulp van mutanten of onschadelijke bacteriën specifieke oppervlakte-eiwitten uiten. Alternatief kunnen farmacologische remmers of blokkerende antilichamen worden toegevoegd aan het medium in de stroom kamer. De rol van gastheerfactoren zoals verschillende bestanddelen van extracellulaire matrix kan worden onderzocht door gebruik dekglaasjes met verschillende coatings. De dekglaasjes kan ook worden bekleed met endotheelcellen, waarvan de activeringsstatus kan worden gemoduleerd door het toevoegen van specifieke stimulatoren. Apart uit de vaatwand, kan de bijdrage van ontvangst bloedcellen en plasma-eiwitten worden bestudeerd door het toevoegen van deze factoren het stromende medium. Zo kunnen verschillende omstandigheden van toenemende complexiteit onder gestandaardiseerde omstandigheden van laminaire stroming worden bestudeerd om de interacties die de bacteriën te hechten aan de bloedvatwand in vivo ontrafelen.
Interacties die in het in vitro model worden vervolgens onderzocht in een diermodel om de relevantie te testen in een complex organisme. Andere in vivo modellen om dynamische interacties onder stroom te bestuderen zijn beschreven, zoals de hamster dorsale huidplooi kamer 12 en de cremaster model 13. In vergelijking, de mesenterische perfusie model beschreven biedt verschillende voordelen vanwege het gebruiksgemak, de mogelijkheid te variëren gastheer genetische achtergrond van de muizen en farmacologische interventies evalueren.
Kortom, de beschreven modellenbieden de mogelijkheid om oppervlakte-eiwitten niet alleen van S. bestuderen aureus, maar vele andere micro-organismen in verschillende gastheersoorten achtergronden, beter inzicht in de pathogenese van vasculaire infectie.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO) Vlaanderen G0466.10, 11I0113N; "Eddy Merckx Research Grant" en het "Sporta onderzoek Grant" voor Pediatric Cardiology, UZ Leuven, België (JC); het Centrum voor Moleculaire en Vasculaire Biologie wordt ondersteund door de Programmafinanciering KU Leuven (PF / 10/014), door de "Geconcentreerde Onderzoeksacties" (GOA 2009/13) van de Universiteit van Leuven en een onderzoek subsidie van Boehringer-Ingelheim.
Materials
| Brain Heart Infusion (BHI) | BD Plastipak | 237500 | |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Oxoid | CM0129 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Invitrogen | 14190-169 | D-PBS |
| 5(6)-carboxy-fluorescein N-hydroxysuccinimidyl ester | Sigma-Aldrich | 21878-25MG-F | fluorescent labeling |
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Roch | 10 735 086 001 | |
| Haemate-P | CSL Behring | PL 15036/0010 | VWF |
| Horm collagen | Takeda | 10500 | collagen |
| 1-well PCA cell culture chambers | Sarstedt | ######## | plastic slips |
| Temgesic | Reckitt Benckiser | 283716 | bruprenorphine |
| Anesketin (Ketamin hydrochloride 115 mg/ml (100 mg/ml ketaminum)) | Eurovet | BE-V136516 | ketamin |
| XYL-M 2% (xylazine hydrochloride 23.32 mg/ml (20 mg/ml xylazine)) | VMD Arendonk | BE-V170581 | xylazine |
| 2 french intravenous catheter green | Portex | 200/300/010 | |
| 0,9% Sodium chloride (NaCl) | Baxter Healthcare | W7124 | |
| cotton swabs | International Medical Product | 300230 | |
| Ca2+-ionophore solution A23187 | Sigma-Aldrich | C7522-10 MG | |
| 26 gauge 1 ml syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| 26 gauge 1 ml syringe with needle | BD Plastipak | 300015 | intra-peritoneal injection |
| Centrifuge 5810-R | Eppendorf | 5811 000.320 | |
| Glass cover slips (24×50) | VWR | BB02405A11 | Thickness No, 1 |
| PHD 2000 Infusion | Harvard Apparatus | 702100 | High-accuracy Harvard infusion pump |
| Axio-observer DI | Carl-Zeiss | Inverted fluorescence microscope | |
| ImageJ | National Institute of Health | Analysis software | |
| Graphpad Prism 5,0 | Graphpad Software | Analysis software | |
| AxioCam MRm | Carl-Zeiss | Black and white camera | |
References
- Vanassche, T., Peetermans, W. E., Herregods, M. C., Herijgers, P., Verhamme, P. Anti-thrombotic therapy in infective endocarditis. Expert Rev Cardiovasc Ther. 9 (9), 1203-1219 (2011).
- Heying, R., van de Gevel, J., Que, Y. A., Moreillon, P., Beekhuizen, H. Fibronectin-binding proteins and clumping factor A in Staphylococcus aureus experimental endocarditis: FnBPA is sufficient to activate human endothelial cells. Thromb Haemost. 97 (4), 617-626 (2007).
- Pappelbaum, K. I., et al. Ultralarge von Willebrand factor fibers mediate luminal Staphylococcus aureus adhesion to an intact endothelial cell layer under shear stress. Circulation. 128 (1), 50-59 (2013).
- Claes, J., et al. Adhesion of Staphylococcus aureus to the vessel wall under flow is mediated by von Willebrand factor–binding protein. Blood. 124 (10), 1669-1976 (2014).
- Thiene, G., Basso, C. Pathology and pathogenesis of infective endocarditis in native heart valves. Cardiovasc Pathol. 15 (5), 256-263 (2006).
- Sixma, J. J., Schiphorst, M. E., Verweij, C. L., Pannekoek, H. Effect of deletion of the A1 domain of von Willebrand factor on its binding to heparin, collagen and platelets in the presence of ristocetin. Eur J Biochem/FEBS. 196 (2), 369-375 (1991).
- Theilmeier, G., Lenaerts, T., Remacle, C., Collen, D., Vermylen, J., Hoylaerts, M. F. Circulating activated platelets assist THP-1 monocytoid/endothelial cell interaction under shear stress. Blood. 94 (8), 2725-2734 (1999).
- Bjerketorp, J., Jacobsson, K., Frykberg, L. The von Willebrand factor-binding protein (vWbp) of Staphylococcus aureus is a coagulase. FEMS Microbiol Lett. 234 (2), 309-314 (2004).
- Friedrich, R., et al. Staphylocoagulase is a prototype for the mechanism of cofactor-induced zymogen activation. Nature. 425 (6957), 535-539 (2003).
- Vanassche, T., et al. Fibrin formation by staphylothrombin facilitates Staphylococcus aureus-induced platelet aggregation. Thromb Haemost. 107 (6), 1107-1121 (2012).
- Vanassche, T., et al. The role of staphylothrombin-mediated fibrin deposition in catheter-related Staphylococcus aureus infections. J Infect Dis. 208 (1), 92-100 (2013).
- Buerkle, M. A., Lehrer, S., Sohn, H. Y., Conzen, P., Pohl, U., Krötz, F. Selective inhibition of cyclooxygenase-2 enhances platelet adhesion in hamster arterioles in vivo. Circulation. 110 (14), 2053-2059 (2004).
- Kim, K. H., Barazia, A., Cho, J. Real-time imaging of heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. J Vis Exp. 2 (74), (2013).
