في المختبر والمجراة نموذج لدراسة التصاق البكتيريا إلى سفينة ستريت تحت ظروف التدفق
Summary
To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.
Abstract
من أجل تسبب التهابات اللف والتهاب الشغاف، تحتاج البكتيريا لتكون قادرة على الانضمام إلى جدار الوعاء الدموي بينما التعرض للإجهاد القص المتدفقة الدم.
تحديد العوامل البكتيرية والمضيفة التي تساهم في التصاق الأوعية الدموية من الكائنات الحية الدقيقة، وهناك حاجة إلى نماذج مناسبة دراسة هذه التفاعلات في ظل ظروف القص الفسيولوجية. هنا، نحن تصف في المختبر تدفق نموذج الغرفة التي تسمح للتحقيق التصاق البكتيريا لمختلف مكونات المصفوفة خارج الخلية أو الخلايا البطانية، ونموذج intravital المجهري التي وضعت لتصور مباشرة التصاق الأولي من البكتيريا إلى الدورة الدموية في الجسم الحي حشوي . ويمكن استخدام هذه الأساليب لتحديد العوامل البكتيرية والمضيفة اللازمة لالتصاق البكتيريا تحت التدفق. نحن لتوضيح أهمية إجهاد القص ودور عامل فون ويلبراند للالتصاق Staphylococcus الذهبية باستخدام كل من في المختبر، ونموذج الجسم الحي.
Introduction
To establish endovascular infections, pathogens require a mechanism to adhere to the endothelium, which lines the vessel wall and the inner surface of the heart, and to persist and establish an infection despite being exposed to the shear stress of rapidly flowing blood. The most frequent pathogen causing life-threatening endovascular infections and infective endocarditis is Staphylococcus aureus (S. aureus)1.
Various bacterial surface-bound adhesive molecules mediate adhesion to host tissue by interacting with extracellular matrix components. These MSCRAMMs (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules) recognize molecules such as fibronectin, fibrinogen, collagen and von Willebrand factor (VWF). MSCRAMMs are important virulence factors of S. aureus and are implicated in the colonization and invasion of the host2. Most studies on these virulence factors have been performed in static conditions, and thus may not be representative for human infections where initial adhesion of the bacteria occurs in flowing blood.
In the case of bloodstream infections, bacteria need to overcome the shearing forces of flowing blood in order to attach to the vessel wall. Models that investigate the interaction between bacteria and endothelium or subendothelium under flow conditions are therefore of particular interest.
A recent study showed that the adhesion of S. aureus to blood vessels under shear stress is mediated by VWF3. VWF, a shear stress-operational protein, is released from endothelial cells upon activation. Circulating VWF binds to collagen fibers of the exposed subendothelial matrix. Our group reported that the von Willebrand factor-binding protein (vWbp) of S. aureus is crucial for shear-mediated adhesion to VWF4.
In this article, we present an in vitro flow chamber model where bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells can be evaluated. To validate the findings from in vitro data, we have developed an in vivo model that visualizes and quantifies the direct interaction of bacteria with the vessel wall and the formation of bacteria-platelet thrombi in the mesenteric circulation of mice, using real-time intravital vascular microscopy.
Protocol
Representative Results
Discussion
إجهاد القص هو عامل حاسم لالتصاق البكتيريا في وقت مبكر لجدار الوعاء الدموي وللجيل اللاحق من اللف أو تنبتات شغافية والتهابات النقيلي 4،5. وصفنا التكميلية في التجارب المختبرية والنماذج الحية لدراسة التسبب في العدوى داخل الأوعية الدموية تحت إجهاد القص الفسيولوجية. وقد سمحت هذه النماذج لنا التعرف فون ويلبراند ملزم عامل البروتين (vWbp) مثل S. الرئيسي البروتين الذهبية للتفاعل في إطار تدفق مع جدار الأوعية الدموية المصاب تعريض VWF 4.
التهابات داخل الأوعية الدموية، والتهاب الشغاف على وجه الخصوص، مصدرا للقلق ليس فقط بسبب فشل الجهاز الناجم عن الإنتان والموت، ولكن أيضا بسبب ('المتنقل') مضاعفات المحلية والبعيدة. أن تسبب التهاب الشغاف والتهابات المتنقل، والبكتيريا يجب أن تلتزم جدار الوعاء الدموي، وبالتالي مقاومة إجهاد القص المتدفقة الدم. معظمدراسات على البكتيريا الفوعة أجريت العوامل في ظروف ثابتة. ومع ذلك، قد أنشأت هذه التفاعلات لا تصمد أمام قوى القص والدراسات في ظل ظروف تدفق يمكن أن تكشف عن عوامل جديدة، غير المعترف بها سابقا في تفاعل البكتيريا المضيف.
باستخدام غرفة تدفق الصغرى بالتوازي مع ذلك، نحن وغيرنا قد أظهرت أهمية VWF للالتصاق الأوعية الدموية. تحت إجهاد القص، VWF تدريجيا يتفتح من هيكلها كروي يستريح، ويعرض المجال A1 التي تتفاعل مع الصفائح الدموية عن طريق مستقبلات GPIB 6 منه. تم غرف تدفق تستخدم على نطاق واسع لدراسة وظيفة الصفائح الدموية 7.
ومن اللافت للنظر أيضا S. الذهبية التصاق تحت تدفق يتطلب VWF، وعلى وجه الخصوص في المجال A1 التي يتعرض لها على القص. حددنا vWbp للتوسط VWF ملزمة. vWbp هو المخثرة التي تساهم في S. الذهبية الفيزيولوجيا المرضية من خلال تفعيل البروثرومبين المضيف. Staphylothrombin، والدقةulting المجمع من المخثرة البكتيرية والبروثرومبين، يحول الفيبرينوجين إلى الليفين غير قابلة للذوبان 8،9. وقد أظهرت دراساتنا أن vWbp لا يتم تنشيط البروثرومبين فحسب، بل يؤدي تشكيل المجاميع البكتيريا الليفين، الصفائح الدموية، التي تعزز التصاق الأوعية الدموية تحت تدفق 4،10،11.
في المختبر تدفق نموذج غرفة يسمح لدراسة مختلف اللاعبين في التصاق البكتيريا إلى المكونات الخلوية أو المصفوفة. عوامل الفوعة البكتيرية يمكن دراستها باستخدام المسوخ أو البكتيريا غير ضارة معربا عن البروتينات السطحية النوعية. بدلا من ذلك، مثبطات دوائية أو الأجسام المضادة حجب يمكن أن تضاف إلى المتوسطة في غرفة التدفق. دور العوامل المضيفة مثل مختلف مكونات المصفوفة خارج الخلية يمكن دراستها باستخدام coverslips مع الطلاء المختلفة. كما يمكن تغطيتها لل coverslips مع الخلايا البطانية، والتي من حالة التنشيط يمكن عن طريق التضمين مضيفا التحفيز والتشجيع محددة. APAغ من جدار الأوعية الدموية، ومساهمة من خلايا الدم المضيفة وبروتينات البلازما يمكن دراستها عن طريق إضافة هذه العوامل إلى المتوسطة المتدفقة. وبالتالي، يمكن دراسة ظروف مختلفة من التعقيد المتزايد في ظل ظروف موحدة للتدفق الصفحي لكشف التفاعلات التي تسمح للبكتيريا على الانضمام إلى جدار الوعاء الدموي في الجسم الحي.
يتم دراسة التفاعلات التي تم تحديدها في نموذج في المختبر في وقت لاحق في نموذج حيواني لاختبار أهميتها في كائن معقد. البعض في النماذج الحية لدراسة التفاعلات الحيوية في ظل تدفق تم وصفها، مثل الهامستر ظهري طبقات الجلد الغرفة 12 ونموذج المشمرة 13. وبالمقارنة، فإن النموذج التروية المساريقي الموصوفة هنا يوفر العديد من المزايا بسبب سهولة استخدامه وإمكانية تختلف استضافة الخلفية الوراثية للفئران وتقييم التدخلات الدوائية.
في الختام، ونماذج وصفهاتوفر إمكانية لدراسة البروتينات السطحية ليس فقط من S. الذهبية، ولكن العديد من الكائنات الحية الدقيقة الأخرى في الخلفيات المضيف مختلفة، من أجل فهم أفضل التسبب في التهابات الأوعية الدموية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل فون للحصول على Wetenschappelijk Onderzoek (FWO) VLAANDEREN G0466.10، 11I0113N. "إدي ميركس منحة بحثية" و "Sporta البحوث غرانت" لأمراض القلب للأطفال، UZ لوفين، بلجيكا (JC)؛ ويدعم مركز الجزيئية والأوعية الدموية الأحياء التي Programmafinanciering KU لوفين (PF / 10/014)، من قبل "Geconcentreerde Onderzoeksacties" (غوا 2009/13) من جامعة لوفين و منحة بحثية من بورنغير إنغلهايم،.
Materials
| Brain Heart Infusion (BHI) | BD Plastipak | 237500 | |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Oxoid | CM0129 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Invitrogen | 14190-169 | D-PBS |
| 5(6)-carboxy-fluorescein N-hydroxysuccinimidyl ester | Sigma-Aldrich | 21878-25MG-F | fluorescent labeling |
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Roch | 10 735 086 001 | |
| Haemate-P | CSL Behring | PL 15036/0010 | VWF |
| Horm collagen | Takeda | 10500 | collagen |
| 1-well PCA cell culture chambers | Sarstedt | ######## | plastic slips |
| Temgesic | Reckitt Benckiser | 283716 | bruprenorphine |
| Anesketin (Ketamin hydrochloride 115 mg/ml (100 mg/ml ketaminum)) | Eurovet | BE-V136516 | ketamin |
| XYL-M 2% (xylazine hydrochloride 23.32 mg/ml (20 mg/ml xylazine)) | VMD Arendonk | BE-V170581 | xylazine |
| 2 french intravenous catheter green | Portex | 200/300/010 | |
| 0,9% Sodium chloride (NaCl) | Baxter Healthcare | W7124 | |
| cotton swabs | International Medical Product | 300230 | |
| Ca2+-ionophore solution A23187 | Sigma-Aldrich | C7522-10 MG | |
| 26 gauge 1 ml syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| 26 gauge 1 ml syringe with needle | BD Plastipak | 300015 | intra-peritoneal injection |
| Centrifuge 5810-R | Eppendorf | 5811 000.320 | |
| Glass cover slips (24×50) | VWR | BB02405A11 | Thickness No, 1 |
| PHD 2000 Infusion | Harvard Apparatus | 702100 | High-accuracy Harvard infusion pump |
| Axio-observer DI | Carl-Zeiss | Inverted fluorescence microscope | |
| ImageJ | National Institute of Health | Analysis software | |
| Graphpad Prism 5,0 | Graphpad Software | Analysis software | |
| AxioCam MRm | Carl-Zeiss | Black and white camera | |
References
- Vanassche, T., Peetermans, W. E., Herregods, M. C., Herijgers, P., Verhamme, P. Anti-thrombotic therapy in infective endocarditis. Expert Rev Cardiovasc Ther. 9 (9), 1203-1219 (2011).
- Heying, R., van de Gevel, J., Que, Y. A., Moreillon, P., Beekhuizen, H. Fibronectin-binding proteins and clumping factor A in Staphylococcus aureus experimental endocarditis: FnBPA is sufficient to activate human endothelial cells. Thromb Haemost. 97 (4), 617-626 (2007).
- Pappelbaum, K. I., et al. Ultralarge von Willebrand factor fibers mediate luminal Staphylococcus aureus adhesion to an intact endothelial cell layer under shear stress. Circulation. 128 (1), 50-59 (2013).
- Claes, J., et al. Adhesion of Staphylococcus aureus to the vessel wall under flow is mediated by von Willebrand factor–binding protein. Blood. 124 (10), 1669-1976 (2014).
- Thiene, G., Basso, C. Pathology and pathogenesis of infective endocarditis in native heart valves. Cardiovasc Pathol. 15 (5), 256-263 (2006).
- Sixma, J. J., Schiphorst, M. E., Verweij, C. L., Pannekoek, H. Effect of deletion of the A1 domain of von Willebrand factor on its binding to heparin, collagen and platelets in the presence of ristocetin. Eur J Biochem/FEBS. 196 (2), 369-375 (1991).
- Theilmeier, G., Lenaerts, T., Remacle, C., Collen, D., Vermylen, J., Hoylaerts, M. F. Circulating activated platelets assist THP-1 monocytoid/endothelial cell interaction under shear stress. Blood. 94 (8), 2725-2734 (1999).
- Bjerketorp, J., Jacobsson, K., Frykberg, L. The von Willebrand factor-binding protein (vWbp) of Staphylococcus aureus is a coagulase. FEMS Microbiol Lett. 234 (2), 309-314 (2004).
- Friedrich, R., et al. Staphylocoagulase is a prototype for the mechanism of cofactor-induced zymogen activation. Nature. 425 (6957), 535-539 (2003).
- Vanassche, T., et al. Fibrin formation by staphylothrombin facilitates Staphylococcus aureus-induced platelet aggregation. Thromb Haemost. 107 (6), 1107-1121 (2012).
- Vanassche, T., et al. The role of staphylothrombin-mediated fibrin deposition in catheter-related Staphylococcus aureus infections. J Infect Dis. 208 (1), 92-100 (2013).
- Buerkle, M. A., Lehrer, S., Sohn, H. Y., Conzen, P., Pohl, U., Krötz, F. Selective inhibition of cyclooxygenase-2 enhances platelet adhesion in hamster arterioles in vivo. Circulation. 110 (14), 2053-2059 (2004).
- Kim, K. H., Barazia, A., Cho, J. Real-time imaging of heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. J Vis Exp. 2 (74), (2013).
