Методы повышения чувствительности с высоким разрешением Melting полиморфизм единичного нуклеотида генотипирования в малярией
Summary
В то время как анализ высокого разрешения плавления дает возможность дифференцировать между отдельными нуклеотидных полиморфизмов в гетерогенной популяции, мутантный аллель смещения усиления может увеличить свою способность обнаруживать аллели, присутствующие при относительно низких процентах в образце. Этот протокол описывает улучшения, которые улучшают чувствительность анализа плавления с высоким разрешением.
Abstract
Несмотря на десятилетия усилий по искоренению, малярия остается глобальное бремя. Последние возобновление интереса к региональной и глобальной ликвидации искоренения сопровождается повышенной геномной информации о Plasmodium паразитов видов, ответственных за малярией, в том числе характеристик географических популяций, а также изменения, связанные с уменьшением восприимчивости к противомалярийных препаратов.
Один из распространенных генетических вариаций, однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), предлагает привлекательные цели для паразита генотипирования. Эти маркеры могут быть использованы не только для отслеживания маркеров лекарственной устойчивости, но и для отслеживания популяций паразита, используя маркеры не под наркотиками или другими селективным давлением.
SNP генотипирования методы дают возможность отслеживать лекарственную устойчивость, а также по отпечатку отдельных паразитов для наблюдения населения, в частности, в ответ на усилия по борьбе с малярией в регионах приближается eliminatионный статус.
В то время как информационные ОНП были определены, которые агностик конкретных технологий генотипирования, анализ высокого разрешения плавления (HRM) особенно подходит исследования на местах на основе. По сравнению со стандартными методами, основанными флуоресцентный зонд-что требуют отдельных ОНП в одном меченым зондом и предлагают в лучшем 10% чувствительность для обнаружения в образцах ОНП, которые содержат несколько геномов (polygenomic), HRM предлагает 2-5% чувствительность. Модификации HRM, такие как блокированных зондов и праймеров концентрации асимметричных а также оптимизации температуры отжига амплификации ПЦР для смещения в направлении усиления минорного аллеля, дополнительно повысить чувствительность HRM. В то время как улучшение чувствительности зависит от конкретного анализа, мы увеличили чувствительность обнаружения до менее чем 1% минорного аллеля.
В регионах, приближающихся по ликвидации малярии, раннее выявление новых или импортного лекарственной устойчивости имеет важное значение для PROmpT ответ. Точно так же, способность обнаруживать polygenomic инфекции и дифференцировать типы импортируемых паразитов из загадочных местных водоемов можете сообщить программ управления.
Эта рукопись описывает изменения в технологии плавления с высоким разрешением, что дальнейшего повышения его чувствительности, чтобы определить polygenomic инфекции в образцах пациента.
Introduction
Несмотря возобновлению интереса в борьбе с малярией и искоренению, малярия остается во всем мире бремя, почти половина населения мира в опасности инфекции и более 550000 смертей в год, особенно детей в Африке к югу от Сахары 1.
Эти новые программы борьбы и ликвидации были поддержаны геномной ренессанса, с большим количеством малярийных паразитов секвенированных и анализируемых мутаций, связанных с пониженной чувствительностью наркотиков, повышенной вирулентностью, и характеристики населения 2,3. Однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) являются одними из наиболее часто выявленных генетических вариантов 4-7.
Портативные SNP генотипирования методы предлагают на месте и наблюдения населения в режиме реального времени и отслеживания 8. В дополнение к отпечатков пальцев каждого паразита индивидуально, то "молекулярная штрих 'также используется для обнаружения драматические временные сдвиги в частот аллелейа также отклонений эффективного размера популяции и сложности инфекции 9.
В то время как этот набор познавательной ОНП легко адаптируется ко многим генотипирования платформ, высокое разрешение плавления (HRM) анализа, в частности, хорошо подходит для полевых основе исследования, где чувствительный и простой операции и выявление новых мутаций при низких затратах по сравнению с секвенирования и других подходы являются привлекательными в условиях ограниченных ресурсов.
HRM начинается с стандартным полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая включает флуоресцентный краситель. После ПЦР плавления анализ определяет температуру плавления пик ампликон; один различие SNP в короткий ампликоном может привести к существенным температуры пик плавления (Tm) различий.
Несколько уточнений к этому методу предложить лучше генотипирования разрешение дифференцировать ОНП в том числе класса IV (AT) ОНП, и обнаружить незначительные мутантные аллели в образцах с множественными аллелями, присутствующих (polygenomic инфекции). Во-первых, анализы включают коротких зондов по центру над области SNP в дополнение к прямого и обратного праймеров, которые присутствуют в различных концентрациях. Эти заблокированные зонды не усиливается во время ПЦР, но связываться с цепи производится в избытке из-за асимметричных концентрации праймеров, которые увеличивают производство зонд-шаблона продукта. Эти отдельные двухцепочечной ампликоны, состоящие из зонда, связанного с избыточным матричной цепи составляют ~ 20-30 б.п.; их значительно уменьшилось по сравнению с длиной всего ампликоном (80-150 б.п.) приведет к гораздо большей разницы Tm, связанных с одной или несколькими базовой зонда-шаблона соответствует 10.
Во-вторых, мутантный аллель смещения усиления (MAAB) понижает температуру отжига реакции для смещения реакцию на мутантных аллелей, присутствующих в низких показателей в polygenomic инфекций. Температура отжига находится между ТМС прекрасно согласованного (дикого типа) и несогласованной (мутантного) зондас. При этой температуре, связывание аллель дикого типа является достаточно стабильным, что амплификация затруднено по сравнению с его несоответствием эквивалента, таким образом, смещение усиления к мутантного аллеля, когда оба присутствуют в одном образце 10.
С помощью этих HRM уточнений, эта технология позволила отслеживать происхождение и идентичность паразитов, связанных с эпидемическим инфекций в Южной Америке 11 и обнаружения новых мутаций, дифференциации нескольких SNP, расположенных в непосредственной близости друг к другу в последовательности, и мутаций присутствует менее чем 1 % из аллелей в polygenomic образцов 10.
Повышенная чувствительность особенно важно в регионах, приближающихся статус предварительной ликвидации и людей, подверженных риску новых лекарственной устойчивости. Возможность быстро и легко идентифицировать ввезенные паразитов и ОНП, связанные с пониженной чувствительностью на месте сообщает усилия надзора и контроля о программыэффективность их реализации и определяет горячие точки для активизации усилий по искоренению малярии и ликвидации. Этот протокол описывает способы заблокированного-зонда на основе и MAAB для повышенная чувствительность HRM генотипирование.
Protocol
Representative Results
Discussion
Непрерывное HRM является шагом анализ пост-ПЦР; Поэтому, выборки и анализа установки аналогичен стандартным протоколам ПЦР, с дополнительным включением флуоресцентным красителем интеркалирующего используется для отслеживания переход от двухцепочечной чтобы одноцепочечной ДНК во время стадии плавления с высоким разрешением. Самым важным фактором для успешного анализа HRM является надежный продукт ПЦР. Анализ дизайн является ключевым, и несколько инструментов, оптимизированных для дизайна HRM анализа имеются в продаже и в Интернете 13. Длина ампликона 80-150 пар оснований с сопутствующей ~ 20 пар оснований заблокирован зонды, сосредоточенные на SNP или ОНП на процентной работы лучших дифференцировать ОНП, а также гаплотипов нескольких ОНП в регионе зонда. Зонды могут быть заблокированы с использованием либо 3 'C3 прокладку или 2 пар оснований несоответствие на 3'-конце, которые предотвращают расширение в процессе амплификации. Зонды могут быть разработаны в соответствии с Уотсон или Крик шаблона прядь; выборзависит от эмпирического тестирования для определения, какой датчик дизайн производит приемлемые пиков плавления. Избыточные вперед или обратный праймеры используются для производства одноцепочечной продукт амплификации, что отжигов на заблокированных зондов. Если зонд содержит последовательность вперед нити, то обратный праймер используют в избытке, как правило, в соотношении 1: 5, и наоборот для зондов, которые соответствуют обратную цепь.
Точно так же, HRM лучше всего работает с достаточной и надежной продукта ПЦР. ПЦР оптимизации реакция требует градиентных ПЦР и агарозном геле или анализа Bioanalyzer определить оптимальные температуры отжига. Шаблон концентрация может быть увеличена с помощью таких методов, как пре-амплификации, необъективной мультиплексной амплификации всех целей с использованием низкой концентрации праймера и число циклов, чтобы увеличить концентрацию шаблона 13.
Только горстка инструментов совместимы с MAAB. Тепловые свойства стеклянных капилляров труб используется Iп эти системы облегчают этот метод. Небольшой внутренний диаметр капилляров, а также быстрая передача тепла через стекла предлагают более строгий контроль температуры, чем стандартный PCR Пластик, который имеет более медленные темпы перехода между отжига и денатурации циклов в связи с теплоизоляционными свойствами пластика. С помощью этого метода, чувствительность обнаружения может быть уменьшена с 2-5% до менее чем 1% мутантного аллеля в смеси дикого типа и мутантных аллелей 10.
HRM является поверхностным, эффективным и экономичным средством для SNP генотипирования в различных условиях и многочисленных приложений, от эпиднадзора за инфекционными болезнями к сканированию для вариантов гена рака. Несколько другие инструменты, такие как Roche Nano и LightCycler систем (480 и 96), а также эко режиме реального времени система ПЦР предложение HRM в дополнение к стандартной усиления, в режиме реального времени, и копия чисел функциональности. Использование выше пропускная способность машины, HRM штриховое кодирование стоит лес чем $ 0,50 за анализе в наших руках, в том числе всех реагентов и расходных материалов.
В контексте описанной здесь, на местах на основе приложения позволяют наблюдение населения в режиме реального времени для изменений, связанных с борьбы с малярией, включая сокращение разнообразия населения, выявление паразитов, ввозимых видов и появления и распространения ОНП, связанных с пониженной чувствительностью наркотиков. Уточнения к методу предлагать дополнительную чувствительность полезную для информирования прогресса на пути к ликвидации малярии и ликвидации.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Фонд Билла и Мелинды Гейтс за поддержку развития технологий и подготовки кадров.
Materials
| LightScanner Master Mix | BioFire Defense | HRLS-ASY-0003 | |
| Light mineral oil | Sigma | M5904 | for BioFire Defense plate-based HRM systems |
| TE | Teknova | T0226 | |
| Te | Teknova | T0221 | TE buffer with reduced EDTA |
| PCR grade water | Teknova | W3330 | |
| Plasmodium falciparum standards | MR4 | MRA-151, 156, 205, 330 | MR4.org offers free genomic DNA |
| Light Scanner Primer Design Software | BioFire Defense | commercial sofware for HRM assay design | |
| LightCycler 480 High Resolution Melting Master Mix | Roche | 4909631001 | For use in LightCycler-480, -96, and nano. 2x concentration |
| Bioanalyzer | Agilent | G2938A | Agilent 2100 bioanalyzer |
| LightCycler 2.0 | Roche | 3531414001 | Capillary-based system for MAAB |
| LightCycler Nano | Roche | 6407773001 | Strip tube-based HRM and amplification |
| LightCycler 96 | Roche | 5815916001 | Strip-tube and plate-based HRM and amplification |
| LightCycler 480 | Roche | 5015278001 | plate-based HRM (96 and 384-well plates) and amplification |
| LightScanner-96 | BioFire Defense | LSCN-ASY-0011 | plate-based HRM (96-well) |
| LightScanner-384 | BioFire Defense | LSCN-ASY-0001 | plate-based HRM (96-well) |
| 96-well plates | Roche | 4729692001 | 96-well plates for HRM (LightCycler |
| 384-well plates | Roche | 4729749001 | 384-well plates for HRM (LightCycler) |
| 96-well plates | Bio-Rad | HSP-9665 | 96-well plates for HRM (LightScanner) |
| 384-well plates | Bio-Rad | HSP-3865 | 384-well plates for HRM (LightScanner) |
| LightCycler 8-Tube Strips (clear) | Roche | 6327672001 | strip tubes for HRM (Light Cycler 96 and Light Cycler Nano) |
| LightCycler Capillaries (20 μl) | Roche | 4929292001 | capillaries for HRM |
| Optical plate seals | Roche | 4729757001 | other brands also work |
References
- . . World Health Organization report 2013. , 1-286 (2013).
- Hayton, K., Su, X. -. Z. Drug resistance and genetic mapping in Plasmodium falciparum. Current genetics. 54 (5), (2008).
- Neafsey, D. E., et al. Genome-wide SNP genotyping highlights the role of natural selection in Plasmodium falciparum population divergence. Genome biology. 9 (12), R171 (2008).
- Volkman, S. K., et al. A genome-wide map of diversity in Plasmodium falciparum. Nature. 39 (1), 113-119 (2007).
- Volkman, S. K., Neafsey, D. E., Schaffner, S. F., Park, D. J., Wirth, D. F. Harnessing genomics and genome biology to understand malaria biology. Nature Reviews Genetics. 13 (5), 315-328 (2012).
- Manske, M., et al. Analysis of Plasmodium falciparum diversity in natural infections by deep sequencing. Nature. 487 (7407), 375-379 (2012).
- Auburn, S., et al. Characterization of within-host Plasmodium falciparum diversity using next-generation sequence data. PLoS ONE. 7 (2), e32891 (2012).
- Daniels, R., et al. A general SNP-based molecular barcode for Plasmodium falciparum identification and tracking. Malaria Journal. 7, 223 (2008).
- Daniels, R., et al. Genetic surveillance detects both clonal and epidemic transmission of malaria following enhanced intervention in Senegal. PLoS ONE. 8 (4), e60780 (2013).
- Daniels, R. R., et al. field-deployable method for genotyping and discovery of single-nucleotide polymorphisms associated with drug resistance in Plasmodium falciparum. Antimicrobial agents and chemotherapy. 56 (6), 2976-2986 (2012).
- Olbadia, N., et al. Clonal outbreak of Plasmodium falciparum in eastern Panama. The Journal of infectious diseases. , (2014).
- Montgomery, J., Wittwer, C. T., Palais, R., Zhou, L. Simultaneous mutation scanning and genotyping by high-resolution DNA melting analysis. Nature protocols. 2 (1), 59-66 (2007).
- Mharakurwa, S., Daniels, R., Scott, A., Wirth, D. F., Thuma, P., Volkman, S. K. Pre-amplification methods for tracking low-grade Plasmodium falciparum populations during scaled-up interventions in Southern Zambia. Malaria Journal. 13, 89 (2014).
