В Ситу обнаружения бактерий внутри парафин тканей с использованием дигоксина меченных ДНК зонд таргетинга 16S рРНК
Summary
Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled 16S rRNA-targeting DNA probes has been described. This protocol can be applied to study the role of bacteria in various diseases such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.
Abstract
The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been reported using various methods, including electron microscopy, immunohistochemistry or immunofluorescence using bacteria-specific antibodies, and fluorescent in situ hybridization (FISH) using a fluorescence-labeled oligonucleotide probe. Nevertheless, these methods are not widely used due to technical limitation or difficulties. Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled DNA probes has been introduced. The paraffin-embedded tissues are the most common form of biopsy tissues available from pathology banks. Bacteria can be detected either in a species-specific or universal manner. Bacterial signals are detected as either discrete forms (coccus, rod, fusiform, and hairy form) of bacteria or dispersed forms. The technique allows other histological information to be obtained: the epithelia, connective tissue, inflammatory infiltrates, and blood vessels are well distinguished. This method can be used to study the role of bacteria in various diseases, such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.
Introduction
Бактерии играют роль в этиологии различных заболеваний полости рта, такие как периодонтит, пульпит, перикоронит, целлюлит, и остеомиелита. Для того, чтобы понять роль бактерий в патогенезе заболевания и контролировать эффект лечения, локализации бактерий в ткани важно. Наличие бактерий в десневой ткани от пациентов с пародонтитом было показано, используя различные методы, в том числе электронной микроскопии 1,2, иммуногистохимии и иммунофлуоресценции с использованием бактерий специфических антител 3-7, и флуоресцентной гибридизации на месте (FISH) с использованием 8 флуоресцентные- помечены олигонуклеотидный зонд ориентации 16S рРНК. Тем не менее, эти методы не нашли широкого применения из-за технических ограничений или трудностей. По сравнению с антителами, зонды, нацеленные 16S рРНК легко производить и достижения видовой специфичности. РЫБЫ оказалась отличным инструментом для визуализации BactEria в своих природных условиях, таких как бляшки биопленки. Тем не менее, применение FISH образцы тканей ограничено из-за флуоресценции различных тканевых компонентов. Например, сильный флуоресценции красных кровяных клеток часто затрудняет применение флуоресцентной технологии в воспаленных тканях, когда они включают кровотечение 9.
Для того, чтобы локализовать бактерии в воспаленных тканей десны, таким образом, на месте методом гибридизации с использованием дигоксигенина (DIG), меченным зондом ДНК была разработана и успешно применена 10,11. Вот Подробный протокол для локализации бактерий в парафиновых срезах тканей с использованием P. gingivalis -специфические и универсальные эубактериальных зонды был описан. Это, в частности, направлены на стандартизацию метода, так что аналогичные результаты могут быть воспроизведены в других лабораториях. Этот протокол позволяет локализацию бактерий в их гистологического контексте и RESULTS высокой воспроизводимостью. Описанный протокол может быть использован для локализации бактерий либо в видоспецифических или универсальным образом в различных тканях. Универсальный датчик особенно полезен для обнаружения бактерий в Полимикробные заболеваний и изучить потенциальную роль бактерий при заболеваниях, где роль конкретных бактерий, не известно.
Protocol
Representative Results
Discussion
Вот протокол локализовать бактерии внутри парафиновых срезах тканей с использованием DIG-меченой ДНК, был описан. Зонд цели ДНК или РНК молекулы бактериального гена 16S рРНК и 16S-рРНК-нацеленные зонды могут быть выполнены в виде либо конкретных видов или универсальное. Специфической гибр…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантом (2013R1A1A3005669) из Национального исследовательского фонда Кореи и гранта (HI13C0016) корейского технологий здравоохранения R & D проекта, Министерство здравоохранения и социального обеспечения.
Materials
| Acetic anhydride | Sigma | 6404 | |
| 50% Dextran sulfate solution | Millipore | S4030 | |
| 50X Denhardt’s solution | Sigma | D2532 | |
| DEPC | Sigma | P159220 | |
| DIG DNA labeling and detection kit | Roche | 11 093 657 910 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| ImmEdge™ Pen | Dako | H-400 | |
| Levamisole | Vector | SP-5000 | |
| Magnesium chloride | Sigma | 246964 | |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Methyl green | Sigma | M6776 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P1648 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Salmon sperm DNA solution | Invitrogen | #15632-011 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
| Sodium citrate | Duksan | D1420 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Amresco | 227 | |
| Triethanolamine-HCl | Sigma | 90279 | |
| Tris-HCl | Research organics | 3098T |
References
- Takarada, H., Cattoni, M., Sugimoto, A., Rose, G. G. Ultrastructural studies of human gingiva. II. The lower part of the pocket epithelium in chronic periodontitis. J. Periodontol. 45 (3), 155-169 (1974).
- Allenspach-Petrzilka, G. E., Guggenheim, B. Bacterial invasion of the periodontium; an important factor in the pathogenesis of periodontitis. J. Clin. Periodontol. 10 (6), 609-617 (1983).
- Saglie, F. R., et al. The presence of bacteria in the oral epithelium in periodontal disease. II. Immunohistochemical identification of bacteria. J. Periodontol. 57 (8), 492-500 (1986).
- Christersson, L. A., Albini, B., Zambon, J. J., Wikesjö, U. M., Genco, R. J. Tissue localization of Actinobacillus actinomycetemcomitans. in human periodontitis. I. Light, immunofluorescence and electron microscopic studies. J. Periodontol. 58 (8), 529-539 (1987).
- Saglie, F. R., Pertuiset, J., Rezende, M. T., Nestor, M., Marfany, A., Cheng, J. In situ. correlative immuno-identification of mononuclear infiltrates and invasive bacteria in diseased gingiva. J. Periodontol. 59 (10), 688-696 (1988).
- Rautemaa, R., et al. Intracellular localization of Porphyromonas gingivalis. thiol proteinase in periodontal tissues of chronic periodontitis patients. Oral Dis. 10 (5), 298-305 (2004).
- Marttila, E., et al. Intracellular localization of Treponema denticola. chymotrypsin-like proteinase in chronic periodontitis. J. Oral Microbiol. 6, (2014).
- Colombo, A. V., da Silva, C. M., Haffajee, A., Colombo, A. P. Identification of intracellular oral species within human crevicular epithelial cells from subjects with chronic periodontitis by fluorescence in situ. hybridization. J. Periodontal Res. 42 (3), 236-243 (2007).
- Abrams, K., Caton, J., Polson, A. Histologic comparisons of interproximal gingival tissues related to the presence or absence of bleeding. J. Periodontol. 55 (11), 629-632 (1984).
- Kim, Y. C., et al. Presence of Porphyromonas gingivalis. and plasma cell dominance in gingival tissues with periodontitis. Oral Dis. 16 (4), 375-381 (2010).
- Choi, Y. S., et al. Porphyromonas gingivalis. and dextran sodium sulfate induce periodontitis through the disruption of physical barriers. Eur. J. Inflammation. 10, 419-431 (2013).
- Choi, Y. S., Kim, Y. C., Ji, S., Choi, Y. Increased bacterial invasion and differential expression of tight junction proteins, growth factors, and growth factor receptors in periodontal lesions. J. Periodontol. 85 (8), e313-e322 (2014).
- Baker, G. C., Smith, J. J., Cowan, D. A. Review and re-analysis of domain-specific 16S primers. J. Microbiol. Methods. 55 (3), 541-555 (2003).
- Hajishengallis, G., et al. A Low-abundance biofilm species orchestrates inflammatory periodontal disease through the commensal microbiota and the complement. Cell Host Microbe. 10 (5), 497-506 (2011).
- Axon, A. Gastric cancer and Helicobacter pylori. Aliment. Pharmacol. Ther. 16 (suppl. 4), 83-88 (2002).
- Fenhalls, G., et al. In situ. detection of Mycobacterium tuberculosis transcripts in human lung granulomas reveals differential gene expression in necrotic lesions. Infect. Immun. 70 (11), 6330-6338 (2002).
