In Situ rilevamento di batteri all'interno dei tessuti in paraffina utilizzando una sonda DNA Digossina marcato targeting 16S rRNA
Summary
Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled 16S rRNA-targeting DNA probes has been described. This protocol can be applied to study the role of bacteria in various diseases such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.
Abstract
The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been reported using various methods, including electron microscopy, immunohistochemistry or immunofluorescence using bacteria-specific antibodies, and fluorescent in situ hybridization (FISH) using a fluorescence-labeled oligonucleotide probe. Nevertheless, these methods are not widely used due to technical limitation or difficulties. Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled DNA probes has been introduced. The paraffin-embedded tissues are the most common form of biopsy tissues available from pathology banks. Bacteria can be detected either in a species-specific or universal manner. Bacterial signals are detected as either discrete forms (coccus, rod, fusiform, and hairy form) of bacteria or dispersed forms. The technique allows other histological information to be obtained: the epithelia, connective tissue, inflammatory infiltrates, and blood vessels are well distinguished. This method can be used to study the role of bacteria in various diseases, such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.
Introduction
I batteri svolgono un ruolo nell'eziologia di varie malattie orali come la parodontite, pulpite, pericoronite, cellulite e osteomielite. Per comprendere il ruolo dei batteri nella patogenesi della malattia e per monitorare l'effetto dei trattamenti, localizzazione di batteri all'interno del tessuto è importante. La presenza di batteri all'interno del tessuto gengivale di pazienti con periodontite è stato dimostrato utilizzando vari metodi, tra cui la microscopia elettronica 1,2, immunoistochimica e immunofluorescenza usando specifici anticorpi batteri-3-7 e ibridazione in situ fluorescente (FISH) 8 utilizzando un fluorescence- sonda oligonucleotide etichettato mira 16S rRNA. Tuttavia, questi metodi non sono ampiamente utilizzati a causa di limitazioni o difficoltà tecniche. Rispetto anticorpi, sonde destinate 16S rRNA sono facili da produrre e realizzare specie specificità. FISH ha dimostrato di essere un ottimo strumento per la visualizzazione di bacteria nei loro ambienti naturali, come la placca biofilm. Tuttavia, l'applicazione di FISH a campioni di tessuto è limitata a causa di autofluorescenza di varie componenti del tessuto. Ad esempio, il forte autofluorescenza di globuli rossi spesso ostacola l'applicazione della tecnologia di fluorescenza ai tessuti infiammati quando coinvolgono sanguinamento 9.
Per localizzare batteri all'interno dei tessuti gengivali infiammati, quindi, un metodo di ibridazione in situ usando un digossigenina (DIG) sonda di DNA -labeled è stato sviluppato e applicato con successo 10,11. Qui un protocollo dettagliato per la localizzazione di batteri nei tessuti inclusi in paraffina utilizzando P. gingivalis sonde eubatteriche specifico d'e universali è stata descritta. È particolarmente focalizzato sulla standardizzazione del metodo in modo che risultati simili possono essere riprodotti in altri laboratori. Questo protocollo permette la localizzazione dei batteri all'interno del loro contesto istologica e il resuLTS sono altamente riproducibili. Il protocollo descritto può essere utilizzato per localizzare batteri sia in modo specie-specifico o universale in vari tessuti. La sonda universale è particolarmente utile per rilevare batteri nelle malattie polimicrobiche e studiare un potenziale ruolo dei batteri nelle malattie dove il ruolo di batteri specifici non è noto.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui un protocollo per localizzare i batteri all'interno dei tessuti inclusi in paraffina utilizzando una sonda di DNA DIG marcato è stato descritto. La sonda obiettivi dei DNA o RNA molecole batterica gene 16S rRNA, e le sonde 16S rRNA-mirate può essere progettato come entrambe le specie-specifico o universale. L'ibridazione specifica del P. Sonda gingivalis -specific a P. gingivalis ma non ad altri batteri orali è stato mostrato in precedenza 10. Al contrario, la sonda e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione (2013R1A1A3005669) dal National Research Foundation di Corea e una borsa di studio (HI13C0016) del coreano Salute Technology R & S del progetto, Ministero della Salute e del Welfare.
Materials
| Acetic anhydride | Sigma | 6404 | |
| 50% Dextran sulfate solution | Millipore | S4030 | |
| 50X Denhardt’s solution | Sigma | D2532 | |
| DEPC | Sigma | P159220 | |
| DIG DNA labeling and detection kit | Roche | 11 093 657 910 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| ImmEdge™ Pen | Dako | H-400 | |
| Levamisole | Vector | SP-5000 | |
| Magnesium chloride | Sigma | 246964 | |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Methyl green | Sigma | M6776 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P1648 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Salmon sperm DNA solution | Invitrogen | #15632-011 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
| Sodium citrate | Duksan | D1420 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Amresco | 227 | |
| Triethanolamine-HCl | Sigma | 90279 | |
| Tris-HCl | Research organics | 3098T |
References
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