In-situ-Nachweis von Bakterien in Paraffin eingebetteten Geweben Unter Verwendung eines Digoxin-markierte DNA-Sonde Targeting 16S rRNA
Summary
Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled 16S rRNA-targeting DNA probes has been described. This protocol can be applied to study the role of bacteria in various diseases such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.
Abstract
The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been reported using various methods, including electron microscopy, immunohistochemistry or immunofluorescence using bacteria-specific antibodies, and fluorescent in situ hybridization (FISH) using a fluorescence-labeled oligonucleotide probe. Nevertheless, these methods are not widely used due to technical limitation or difficulties. Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled DNA probes has been introduced. The paraffin-embedded tissues are the most common form of biopsy tissues available from pathology banks. Bacteria can be detected either in a species-specific or universal manner. Bacterial signals are detected as either discrete forms (coccus, rod, fusiform, and hairy form) of bacteria or dispersed forms. The technique allows other histological information to be obtained: the epithelia, connective tissue, inflammatory infiltrates, and blood vessels are well distinguished. This method can be used to study the role of bacteria in various diseases, such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.
Introduction
Bakterien spielen eine Rolle in der Ätiologie der verschiedenen oralen Erkrankungen wie Parodontitis, Pulpitis, Perikoronitis, Cellulitis und Osteomyelitis. Um die Rolle von Bakterien in der Pathogenese der Krankheit zu verstehen und um die Wirkung der Behandlung zu überwachen, ist die Lokalisierung von Bakterien innerhalb des Gewebes wichtig. Die Anwesenheit von Bakterien im Zahnfleischgewebe von Patienten mit Periodontitis wurde mit verschiedenen Methoden dargestellt, mit Elektronenmikroskopie 1,2, Immunhistochemie und Immunfluoreszenz unter Verwendung von Bakterien-spezifischen Antikörpern 3-7 und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) unter Verwendung eines Fluoreszenz-8 markierte Oligonukleotidsonde Targeting 16S-rRNA. Gleichwohl sind diese Verfahren nicht in großem Umfang aufgrund technischer Einschränkungen oder Schwierigkeiten eingesetzt. Verglichen mit den Antikörpern, sind Sonden Targeting 16S rRNA einfach herzustellen und zu erreichen Artspezifität. FISH hat sich als ein hervorragendes Werkzeug zur Visualisierung von bact seineria in ihrer natürlichen Umgebung, wie beispielsweise Plaque-Biofilm. Jedoch ist die Anwendung der FISH zur Gewebeproben aufgrund Autofluoreszenz der verschiedenen Gewebekomponenten beschränkt. Zum Beispiel die starke Autofluoreszenz von roten Blutkörperchen die oft den Einsatz von Fluoreszenz-Technologie entzündeten Geweben, wenn sie beinhalten Blutungen 9.
Um Bakterien in den entzündeten Zahnfleischgewebe zu lokalisieren, damit eine in situ-Hybridisierungsverfahren unter Verwendung einer Digoxigenin (DIG) -markierten DNA-Sonde wurde entwickelt und erfolgreich angewendet 10,11. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Lokalisierung von Bakterien in Paraffin eingebettetem Gewebe unter Verwendung von P. gingivalis-spezifischen und universellen eubakteriellen Sonden wurde beschrieben. Es wird besonders auf die Standardisierung des Verfahrens so, dass ähnliche Ergebnisse in anderen Labors reproduziert werden konzentriert. Dieses Protokoll ermöglicht die Lokalisierung von Bakterien in ihrem Kontext und der histologischen results sind hoch reproduzierbar. Das beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um Bakterien entweder in einer artspezifischen oder universell in verschiedenen Geweben zu lokalisieren. Die Universalsonde ist besonders nützlich, um Bakterien in polymicrobial Krankheiten zu detektieren und eine mögliche Rolle von Bakterien bei Krankheiten zu studieren, wo die Rolle von spezifischen Bakterien nicht bekannt ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier ein Protokoll, um Bakterien in Paraffin eingebetteten Gewebe unter Verwendung eines DIG-markierte DNA-Sonde wurde beschrieben zu lokalisieren. Die Sonde selektiv DNA oder RNA-Moleküle von bakteriellen 16S-rRNA-Gens und des 16S-rRNA-Targeting-Sonden können entweder als artspezifische oder Universal ausgebildet sein. Die spezifische Hybridisierung des P. gingivalis-spezifischen Sonde an P. gingivalis, aber nicht auf andere orale Bakterien wurde bereits gezeigt worden 10. Im Gegensatz da…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde unterstützt durch einen Zuschuss (2013R1A1A3005669) von der National Research Foundation Korea und einem Zuschuss (HI13C0016) des koreanischen Health Technology R & D Project, Ministerium für Gesundheit und Wohlfahrt unterstützt.
Materials
| Acetic anhydride | Sigma | 6404 | |
| 50% Dextran sulfate solution | Millipore | S4030 | |
| 50X Denhardt’s solution | Sigma | D2532 | |
| DEPC | Sigma | P159220 | |
| DIG DNA labeling and detection kit | Roche | 11 093 657 910 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| ImmEdge™ Pen | Dako | H-400 | |
| Levamisole | Vector | SP-5000 | |
| Magnesium chloride | Sigma | 246964 | |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Methyl green | Sigma | M6776 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P1648 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Salmon sperm DNA solution | Invitrogen | #15632-011 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
| Sodium citrate | Duksan | D1420 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Amresco | 227 | |
| Triethanolamine-HCl | Sigma | 90279 | |
| Tris-HCl | Research organics | 3098T |
References
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