In Situ détection des bactéries dans les tissus inclus en paraffine Utiliser une sonde ADN de digoxine marqué ciblage ARNr 16S
Summary
Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled 16S rRNA-targeting DNA probes has been described. This protocol can be applied to study the role of bacteria in various diseases such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.
Abstract
The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been reported using various methods, including electron microscopy, immunohistochemistry or immunofluorescence using bacteria-specific antibodies, and fluorescent in situ hybridization (FISH) using a fluorescence-labeled oligonucleotide probe. Nevertheless, these methods are not widely used due to technical limitation or difficulties. Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled DNA probes has been introduced. The paraffin-embedded tissues are the most common form of biopsy tissues available from pathology banks. Bacteria can be detected either in a species-specific or universal manner. Bacterial signals are detected as either discrete forms (coccus, rod, fusiform, and hairy form) of bacteria or dispersed forms. The technique allows other histological information to be obtained: the epithelia, connective tissue, inflammatory infiltrates, and blood vessels are well distinguished. This method can be used to study the role of bacteria in various diseases, such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.
Introduction
Les bactéries jouent un rôle dans l'étiologie de diverses maladies orales telles que la parodontite, pulpite, péricoronarite, la cellulite et l'ostéomyélite. Afin de comprendre le rôle des bactéries dans la pathogenèse de la maladie et de suivre l'effet des traitements, la localisation des bactéries dans le tissu est importante. La présence de bactéries dans le tissu gingival de patients atteints de parodontite a été démontré en utilisant divers procédés, notamment la microscopie électronique 1,2, immunohistochimie et immunofluorescence en utilisant des anticorps spécifiques aux bactéries 3-7, et hybridation fluorescente in situ (FISH) 8 par fluorescence en utilisant un sonde oligonucléotidique marquée ciblage ARN ribosomique 16S. Néanmoins, ces méthodes ne sont pas largement utilisés en raison de limitations techniques ou difficultés. Comparé avec des anticorps, des sondes ciblant les ARN ribosomique 16S sont faciles à produire et réaliser spécificité d'espèce. FISH est avéré être un excellent outil pour la visualisation de bacteria dans leurs milieux naturels tels que le biofilm. Cependant, l'application de poissons à des échantillons de tissus est limitée en raison de l'autofluorescence des différentes composantes du tissu. Par exemple, la forte autofluorescence des cellules rouges du sang entrave souvent l'application de la technologie de fluorescence de tissus enflammés lorsqu'ils impliquent le saignement 9.
Afin de localiser les bactéries dans les tissus gingivaux enflammés, par conséquent, un procédé d'hybridation in situ en utilisant une digoxigénine (DIG) sonde d'ADN marqué au a été développée et appliquée avec succès 10,11. Voici un protocole détaillé pour la localisation des bactéries dans les tissus inclus dans la paraffine en utilisant P. gingivalis sondes eubactériennes spécifique de et universels a été décrite. Il se concentre particulièrement sur la normalisation de la méthode de sorte que des résultats similaires peuvent être reproduits dans d'autres laboratoires. Ce protocole permet la localisation des bactéries dans leur contexte histologique et le résuLTS sont hautement reproductibles. Le protocole décrit peut être utilisé pour localiser les bactéries, soit d'une manière spécifique à l'espèce ou universel dans divers tissus. La sonde universelle est particulièrement utile pour détecter les bactéries dans les maladies polymicrobiennes et d'étudier le rôle potentiel des bactéries dans des maladies où le rôle des bactéries spécifiques est pas connue.
Protocol
Representative Results
Discussion
Voici un protocole de localiser les bactéries dans les tissus inclus dans la paraffine en utilisant une sonde d'ADN marquée au DIG a été décrit. La sonde cible les molécules d'ADN ou d'ARN du gène de l'ARNr 16S bactérien, et les sondes d'ARNr 16S-ciblage peut être conçue soit comme spécifique de l'espèce ou universel. L'hybridation spécifique de la P. La sonde gingivalis de P. gingivalis mais pas à d'autres bactéries orales a été 10 p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été soutenue par une subvention (2013R1A1A3005669) de la National Research Foundation de Corée et une subvention (HI13C0016) de la Corée technologies de la santé Projet R & D, Ministère de la Santé et Bien-être.
Materials
| Acetic anhydride | Sigma | 6404 | |
| 50% Dextran sulfate solution | Millipore | S4030 | |
| 50X Denhardt’s solution | Sigma | D2532 | |
| DEPC | Sigma | P159220 | |
| DIG DNA labeling and detection kit | Roche | 11 093 657 910 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| ImmEdge™ Pen | Dako | H-400 | |
| Levamisole | Vector | SP-5000 | |
| Magnesium chloride | Sigma | 246964 | |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Methyl green | Sigma | M6776 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P1648 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Salmon sperm DNA solution | Invitrogen | #15632-011 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
| Sodium citrate | Duksan | D1420 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Amresco | 227 | |
| Triethanolamine-HCl | Sigma | 90279 | |
| Tris-HCl | Research organics | 3098T |
References
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