الكشف الموضعي من البكتيريا داخل أنسجة البارافين جزءا لا يتجزأ من استخدام المسمى الديجوكسين DNA التحقيق استهداف 16S الريباسي
Summary
Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled 16S rRNA-targeting DNA probes has been described. This protocol can be applied to study the role of bacteria in various diseases such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.
Abstract
The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been reported using various methods, including electron microscopy, immunohistochemistry or immunofluorescence using bacteria-specific antibodies, and fluorescent in situ hybridization (FISH) using a fluorescence-labeled oligonucleotide probe. Nevertheless, these methods are not widely used due to technical limitation or difficulties. Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled DNA probes has been introduced. The paraffin-embedded tissues are the most common form of biopsy tissues available from pathology banks. Bacteria can be detected either in a species-specific or universal manner. Bacterial signals are detected as either discrete forms (coccus, rod, fusiform, and hairy form) of bacteria or dispersed forms. The technique allows other histological information to be obtained: the epithelia, connective tissue, inflammatory infiltrates, and blood vessels are well distinguished. This method can be used to study the role of bacteria in various diseases, such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.
Introduction
البكتيريا تلعب دورا في مسببات الأمراض المختلفة عن طريق الفم مثل اللثة، التهاب لب السن، التهاب حوائط التاج، التهاب النسيج الخلوي، والتهاب العظم والنقي. من أجل فهم دور البكتيريا في التسبب في المرض ورصد تأثير العلاج، وتوطين البكتيريا داخل الأنسجة هو المهم. وقد تبين وجود البكتيريا داخل أنسجة اللثة من المرضى الذين يعانون من التهاب اللثة باستخدام أساليب مختلفة، بما في ذلك الإلكترون المجهري 1،2، المناعية والمناعي باستخدام بكتيريا محددة الأجسام المضادة 3-7، وفلوري التهجين في الموقع (FISH) 8 في استخدام fluorescence- وصفت التحقيق النوكليوتيد استهداف 16S الريباسي. ومع ذلك، لا تستخدم هذه الأساليب على نطاق واسع بسبب قيود أو صعوبات التقني. مقارنة مع الأجسام المضادة، تحقيقات تستهدف 16S الريباسي سهلة لإنتاج وتحقيق الأنواع خصوصية. وقد ثبت FISH أن تكون أداة ممتازة لتصور من جرثومةeria في البيئات الطبيعية من قبيل بيوفيلم البلاك. ومع ذلك، تطبيق FISH لعينات الأنسجة محدودة بسبب تألق ذاتي من مختلف مكونات النسيج. على سبيل المثال، وتألق ذاتي قوي من خلايا الدم الحمراء في كثير من الأحيان يعيق تطبيق التكنولوجيا مضان إلى الأنسجة الملتهبة عندما تتضمن نزيفا 9.
من أجل توطين البكتيريا داخل أنسجة اللثة الملتهبة، لذلك، وهو في الموقع أسلوب التهجين باستخدام digoxigenin وقد وضعت (DIG) التحقيق DNA -labeled وتطبيقها بنجاح 10،11. هنا بروتوكول مفصلة لتوطين البكتيريا داخل أنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين باستخدام P. وقد وصفت اللثوية تحقيقات eubacterial -specific والعالمية. ويركز بشكل خاص على توحيد طريقة بحيث نتائج مماثلة يمكن أن تكون مستنسخة في مختبرات أخرى. هذا البروتوكول يسمح توطين البكتيريا داخل سياقها النسيجي ودورة الفتشوبLTS هي تكرار للغاية. بروتوكول صفها يمكن استخدامها لتوطين البكتيريا إما بطريقة أنواع محددة أو عالمية في الأنسجة المختلفة. التحقيق الشامل هو مفيدة بشكل خاص للكشف عن البكتيريا في الأمراض متعدد المكروبات ودراسة دور محتمل للبكتيريا في الأمراض التي لا يعرف دور البكتيريا محددة.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا بروتوكول لتوطين البكتيريا داخل أنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين باستخدام مسبار الحمض النووي المسمى DIG وقد وصفت. التحقيق يستهدف DNA أو RNA الجزيئات من البكتيريا 16S الريباسي الجينات، وتحقيقات 16S الريباسي التي تستهدف يمكن أن تصمم إما أنواع محددة أو عالمية. التهجين محدد…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذه الدراسة عن طريق منحة (2013R1A1A3005669) من المؤسسة الوطنية لكوريا البحوث ومنحة (HI13C0016) من الكورية صحة التكنولوجيا R & D المشروع، وزارة الصحة والرعاية الاجتماعية.
Materials
| Acetic anhydride | Sigma | 6404 | |
| 50% Dextran sulfate solution | Millipore | S4030 | |
| 50X Denhardt’s solution | Sigma | D2532 | |
| DEPC | Sigma | P159220 | |
| DIG DNA labeling and detection kit | Roche | 11 093 657 910 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| ImmEdge™ Pen | Dako | H-400 | |
| Levamisole | Vector | SP-5000 | |
| Magnesium chloride | Sigma | 246964 | |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Methyl green | Sigma | M6776 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P1648 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Salmon sperm DNA solution | Invitrogen | #15632-011 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
| Sodium citrate | Duksan | D1420 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Amresco | 227 | |
| Triethanolamine-HCl | Sigma | 90279 | |
| Tris-HCl | Research organics | 3098T |
References
- Takarada, H., Cattoni, M., Sugimoto, A., Rose, G. G. Ultrastructural studies of human gingiva. II. The lower part of the pocket epithelium in chronic periodontitis. J. Periodontol. 45 (3), 155-169 (1974).
- Allenspach-Petrzilka, G. E., Guggenheim, B. Bacterial invasion of the periodontium; an important factor in the pathogenesis of periodontitis. J. Clin. Periodontol. 10 (6), 609-617 (1983).
- Saglie, F. R., et al. The presence of bacteria in the oral epithelium in periodontal disease. II. Immunohistochemical identification of bacteria. J. Periodontol. 57 (8), 492-500 (1986).
- Christersson, L. A., Albini, B., Zambon, J. J., Wikesjö, U. M., Genco, R. J. Tissue localization of Actinobacillus actinomycetemcomitans. in human periodontitis. I. Light, immunofluorescence and electron microscopic studies. J. Periodontol. 58 (8), 529-539 (1987).
- Saglie, F. R., Pertuiset, J., Rezende, M. T., Nestor, M., Marfany, A., Cheng, J. In situ. correlative immuno-identification of mononuclear infiltrates and invasive bacteria in diseased gingiva. J. Periodontol. 59 (10), 688-696 (1988).
- Rautemaa, R., et al. Intracellular localization of Porphyromonas gingivalis. thiol proteinase in periodontal tissues of chronic periodontitis patients. Oral Dis. 10 (5), 298-305 (2004).
- Marttila, E., et al. Intracellular localization of Treponema denticola. chymotrypsin-like proteinase in chronic periodontitis. J. Oral Microbiol. 6, (2014).
- Colombo, A. V., da Silva, C. M., Haffajee, A., Colombo, A. P. Identification of intracellular oral species within human crevicular epithelial cells from subjects with chronic periodontitis by fluorescence in situ. hybridization. J. Periodontal Res. 42 (3), 236-243 (2007).
- Abrams, K., Caton, J., Polson, A. Histologic comparisons of interproximal gingival tissues related to the presence or absence of bleeding. J. Periodontol. 55 (11), 629-632 (1984).
- Kim, Y. C., et al. Presence of Porphyromonas gingivalis. and plasma cell dominance in gingival tissues with periodontitis. Oral Dis. 16 (4), 375-381 (2010).
- Choi, Y. S., et al. Porphyromonas gingivalis. and dextran sodium sulfate induce periodontitis through the disruption of physical barriers. Eur. J. Inflammation. 10, 419-431 (2013).
- Choi, Y. S., Kim, Y. C., Ji, S., Choi, Y. Increased bacterial invasion and differential expression of tight junction proteins, growth factors, and growth factor receptors in periodontal lesions. J. Periodontol. 85 (8), e313-e322 (2014).
- Baker, G. C., Smith, J. J., Cowan, D. A. Review and re-analysis of domain-specific 16S primers. J. Microbiol. Methods. 55 (3), 541-555 (2003).
- Hajishengallis, G., et al. A Low-abundance biofilm species orchestrates inflammatory periodontal disease through the commensal microbiota and the complement. Cell Host Microbe. 10 (5), 497-506 (2011).
- Axon, A. Gastric cancer and Helicobacter pylori. Aliment. Pharmacol. Ther. 16 (suppl. 4), 83-88 (2002).
- Fenhalls, G., et al. In situ. detection of Mycobacterium tuberculosis transcripts in human lung granulomas reveals differential gene expression in necrotic lesions. Infect. Immun. 70 (11), 6330-6338 (2002).
