والمائية الميكروبية Metaproteomics سير العمل: من الخلايا إلى زيتية الببتيدات مناسبة لتحليل يستند الطيف، جنبا إلى جنب الشامل
Summary
This protocol is for the extraction and concentration of protein and DNA from microbial biomass collected from seawater, followed by the generation of tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based proteomic analysis.
Abstract
Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and metabolism. Although powerful, metagenomics alone can only elucidate functional potential. On the other hand, metaproteomics enables the description of the expressed in situ metabolism and function of a community. Here we describe a protocol for cell lysis, protein and DNA isolation, as well as peptide digestion and extraction from marine microbial cells collected on a cartridge filter unit (such as the Sterivex filter unit) and preserved in an RNA stabilization solution (like RNAlater). In mass spectrometry-based proteomics studies, the identification of peptides and proteins is performed by comparing peptide tandem mass spectra to a database of translated nucleotide sequences. Including the metagenome of a sample in the search database increases the number of peptides and proteins that can be identified from the mass spectra. Hence, in this protocol DNA is isolated from the same filter, which can be used subsequently for metagenomic analysis.
Introduction
الكائنات الحية الدقيقة في كل مكان وتلعب أدوارا أساسية في دورات الأرض البيولوجية الكيميائية 1. حاليا، هناك العديد من المناهج الجزيئية المتاحة لتحديد خصائص بنية المجتمع الميكروبي والوظيفة. الأكثر شيوعا هو تحليل 16S الريباسي الجينات تسلسل PCR تضخيم من الحمض النووي البيئية 2-4. عيوب تحليل الجينات 16S الريباسي هو أنه لا يقدم سوى معلومات عن هوية النشوء والتطور وبنية المجتمع، مع القليل من المعلومات عن وظيفة التمثيل الغذائي. في المقابل، تقترب مثل metagenomics، metatranscriptomics وmetaproteomics تقديم معلومات عن بنية المجتمع والتمثيل الغذائي. توفر Metagenomics، أو تحليل المحتوى الجيني لفيف من الكائنات الحية، معلومات عن هيكل والإمكانات الوظيفية للمجتمع 5-8. وعلى الرغم من قوة، وهذه الإمكانات الوظيفية قد لا تتوافق مع الأيضيةأنشطة الكائنات الحية. ويمثل النمط الوراثي للكائن التي كتبها جيناته، كل منها يمكن نسخها إلى RNA وكذلك ترجمت إلى البروتين، مما أدى إلى النمط الظاهري. وهكذا، للمساعدة في فهم النشاط الوظيفي الميكروبي في بيئة وتحليل ما بعد الجينوم يجب أن يتم تنفيذ 9. Metatranscriptomics، أو تحليل النصوص RNA هو مفيد لأنه يكشف الجينات التي تم نسخها في أي بيئة معينة. ومع ذلك، مستويات مرنا لا تتطابق دائما مستويات البروتين يناظرها بسبب تنظيم متعدية، RNA نصف الحياة، وحقيقة أن نسخ متعددة من البروتين يمكن أن تتولد عن كل مرنا 10.
لهذه الأسباب metaproteomics ومن المسلم به الآن كأداة هامة لعلم الأحياء الدقيقة البيئي. يحلل metaproteomic شيوعا استخدام نهج البروتين طلقات نارية حيث يتم تنقية كاملة القريب من البروتينات في عينة المعقدة وتحليلها في وقت واحد، وعادة من خلال ENالهضم zymatic إلى ببتيدات والتحليل على مطياف الكتلة. يستخدم لاحق جنبا إلى جنب مطياف الكتلة (MS / MS) "البصمات الببتيد" لتحديد تسلسل الببتيد والمحتملين البروتين من أصل بواسطة قاعدة بيانات البروتين البحث (لاستعراض رؤية 11). لقد حان عمل البروتين شوطا طويلا في السنوات ال 25 الماضية بفضل الزيادة في توافر البيانات الجينومية وزيادة حساسية ودقة الطيف الجماعية والسماح لتحديد البروتين الإنتاجية العالية وتقدير 11،12. منذ البروتينات هي المنتج النهائي في التعبير الجيني، يمكن للبيانات metaproteomic تساعد في تحديد الكائنات التي تنشط في أي بيئة معينة وما البروتينات فإنهم يعبرون. هذا هو المفيد عند محاولة تحديد كيف يمكن لمجموعة معينة من المتغيرات البيئية سوف تؤثر على النمط الظاهري للكائن الحي أو المجتمع. في وقت مبكر، واستخدمت دراسات metaproteomic يستند إلى MS-MS / في المحيط لتحديد بروتينات معينة في المستهدفةالأنساب الميكروبية، مع أول دراسة تركز على ضوء مدفوعة مضخة البروتون proteorhodopsin في البكتيريا البحرية SAR11 13. وفي الآونة الأخيرة، توضيح التحليلات metaproteomic المقارنة التفاضلية أنماط التعبير البروتين بين المجتمعات المعقدة. ومن الأمثلة على ذلك تحديد التحولات الزمنية في عملية التمثيل الغذائي في المناطق الساحلية شمال غرب المحيط الأطلسي 14 أو شبه الجزيرة القطبية الجنوبية 5. وقد وصفت دراسات أخرى الاختلافات في أنماط التعبير البروتين عبر النطاقات المكانية، على سبيل المثال، على طول قطاع من الجغرافي من تلفيف المحيط منخفضة في المغذيات إلى نظام الموجات المتقلبة الساحلي مثمرة للغاية (15). للحصول على مزيد من الآراء metaproteomics نوصي شنايدر وآخرون (2010) 9 ويليامز وآخرون (2014) 16. كما تم توظيف البروتينات المستهدفة في السنوات الأخيرة لتحديد التعبير من المسارات الأيضية محددة في البيئة 17،18.
ذره هي ثلاث مراحل رئيسية في التحليل metaproteomic. المرحلة الأولى هي إعداد نموذج، والذي يتضمن جمع العينات، تحلل الخلية وتركيز البروتين. جمع العينات في علم الأحياء المجهرية البحرية غالبا ما ينطوي على ترشيح مياه البحر من خلال ما قبل التصفية لإزالة الخلايا حقيقية النواة أكبر والجزيئات والبكتيريا المرتبطة الجسيمات، تليها الترشيح للقبض على الخلايا الميكروبية تعيش حرة، عادة مع استخدام خرطوشة 0.22 ميكرومتر وحدة تصفية 19،20. وincased هذه المرشحات في اسطوانة بلاستيكية وسيكون لتحلل الخلايا والبروتين بروتوكول الاستخراج التي يمكن القيام بها داخل وحدة مرشح أن يكون أداة قيمة. مرة واحدة يتم الحصول على الكتلة الحيوية، ويجب أن يكون هي lysed الخلايا للسماح لاستخراج البروتين. يمكن استخدام العديد من الطرق، بما في ذلك غوانيدين، حمض الهيدروكلوريك تحلل 21 والصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS) وسائل تحلل المستندة. على الرغم من المنظفات مثل SDS هي فعالة جدا في تعطيل الأغشية والانحلال العديد من أنواع البروتين، concentratiإضافات منخفضة كما يمكن أن تتداخل مع 0.1٪ المصب الهضم من البروتين وتحليل MS 22. قلق كبير من الآثار السلبية للSDS على كفاءة الهضم التربسين، حل السلطة من العكسي اللوني المرحلة السائلة والأيونات قمع أو تراكم داخل المصدر أيون 23.
المرحلة الثانية هي تجزئة وتحليل، حيث يتعرضون للبروتينات الهضم الأنزيمي تليها تحليل LC MS / MS، مما أدى إلى نمط تجزئة صباحا / ض التي يمكن استخدامها للتأكد من تسلسل الحمض الأميني الأساسي للالببتيد زيتية الأولي. لا يمكن أن يؤديها أساليب الهضم المختلفة تبعا لأنواع المنظفات المستخدمة، وكذلك المصب سير العمل مطياف الكتلة. في بروتوكول لدينا، ويستخدم 1-D PAGE الكهربائي تليها إزالة SDS من الجل من أجل إزالة أي تلوث المنظفات. تحليل البروتينات التي يصعب إذابة، مثل بروتينات الغشاء، يتطلب استخدام concen عاليةtrations من SDS أو المنظفات الأخرى. وهذا يؤدي إلى مشاكل التوافق مع SDS هلام الكهربائي. إذا كان الهدف من الدراسة يتطلب الإذابة هذه بجد لإذابة البروتينات، ونظام أنبوب هلام يمكن استخدامها 22،24. يتضمن طريقة أنبوب هلام البروتينات داخل المصفوفة هلام دون استخدام الكهربائي. بعد ذلك يتم إزالة أي المنظفات المستخدمة لإذابة قبل هضم البروتين.
المرحلة الثالثة هي تحليل بيوينفورمتيك. في هذه المرحلة يتم البحث في البيانات الببتيد MS / MS ضد قاعدة بيانات للتسلسل النوكليوتيدات ترجمتها لتحديد الببتيدات والبروتينات موجودة في العينة. تحديد الببتيدات يعتمد على قاعدة بيانات يتم البحث عنها ضد. يتم البحث بيانات metaproteomic البحرية عادة ضد قواعد البيانات تتألف من الجينوم المرجعية والبيانات metagenomic مثل مجموعة البيانات العالمية المحيط أخذ العينات 25، فضلا عن خلية تضخيم الجينوم واحدة من لى غير المزروعةneages 26،27. ويمكن أيضا زيادة تحديد البروتين من خلال إدراج تسلسل metagenomic من نفس العينة كما يتضح من البيانات metaproteomic وقد اشتق 5.
نحن هنا نقدم بروتوكول لتوليد الببتيدات مناسبة لتحليل يستند إلى MS-MS / الكتلة الحيوية الميكروبية التي تم جمعها من طريق الترشيح وتخزينها في محلول استقرار RNA. بروتوكول الموصوفة هنا يسمح للDNA والبروتين لتكون معزولة من نفس العينة حتى يتسنى لجميع الخطوات المؤدية إلى البروتين والأمطار DNA متطابقة. من منظور عملي، مطلوب أقل الترشيح منذ مطلوب مرشح واحد فقط لكل من البروتين واستخراج الحمض النووي. ونود أيضا أن نعترف أنه تم إنشاء هذا البروتوكول من خلال الجمع بين والتكيف وتعديل بروتوكولين المنشورة سابقا. يتم تكييفها الخطوات تحلل الخلية من سايتو وآخرون (2011) 28 ويتم تكييف التربسين في جل هضم مكون من ShevcheNKO وآخرون. (2007) 29.
Protocol
Representative Results
Discussion
الحفاظ على عينة هو المفتاح لدراسات metaproteomic وأظهرت الأعمال السابقة أن الحل استقرار RNA هو عازلة تخزين مفيد لتخزين الخلايا قبل البروتين استخراج 28. من الناحية المثالية، سوف يتم الحفاظ على عينات في الموقع لنفي التحولات في تعبير البروتين أثناء التعامل مع 33،34….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Marcos Di Falco for his expertise and advice with the preparation of the samples for nano-LC MS/MS as well as Dr. Zoran Minic from the University of Regina for the LC MS/MS analysis. This work was supported by NSERC (DG402214-2011) and CRC (950-221184) funding. D.C. was supported by Concordia Institute for Water, Energy, and Sustainable Systems and FQRNT.
Materials
| Sterivex -GP 0.22 μm filter unit | Millipore | SVGP01050 | Sampling |
| RNAlater Stabilization Solution | Ambion | AM7021 | Sampling |
| Tris | Bio Basic | 77-86-1 or TB0196-500G | Protein Extraction/ SDS PAGE gel |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632-1G | Protein Extraction |
| SDS | Bio Basic | 15-21-3 | Protein Extraction/ SDS PAGE gel |
| EDTA | Bio Basic | 6381-92-6 | Protein Extraction |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | Protein Extraction |
| 10K Amicon Filter | Millipore | UFC801024 | Protein Extraction |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-4L | Protein Precipitation |
| Acetone | Fisher Scientific | 67-64-1 | Protein Precipitation |
| MPC Protein Precipitation reagent | Epicenter | mmP03750 | DNA Precipitation |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | 67-63-0 | DNA Precipitation |
| Qubit dsDNA BR Assay kit | Life Technologies | Q32850 | DNA Quantification |
| Qubit Protein Assay kit | Life Technologies | Q33211 | Protein Quantification |
| Sucrose | Bio Basic | 57-50-1 | SDS PAGE gel |
| TEMED | Bio Rad | 161-0800 | SDS PAGE gel |
| APS | Bio Rad | 161-0700 | SDS PAGE gel |
| 30% Acrylamide | Bio Rad | 161-0158 | SDS PAGE gel |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | SDS PAGE gel |
| Glycine | Bio Rad | 161-0718 | SDS PAGE gel |
| B-mercaptoethanol | Bio Basic | 60-24-2 | SDS PAGE gel |
| Laemmli Sample Buffer | Bio Rad | 161-0737 | SDS PAGE gel |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Ladder | Bio Rad | 161-0375EDU | SDS PAGE gel |
| Acetonitrile | VWR | CABDH6044-4 | In-gel Trypsin digest |
| NH4HCO3 | Bio Basic | 1066-33-7 | In-gel Trypsin digest |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632-1G | In-gel Trypsin digest |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | F0507-500ML | In-gel Trypsin digest |
| HPLC grade H2O | Sigma-Aldrich | 270733-4L | In-gel Trypsin digest |
| Iodoacetamide | Bio Basic | 144-48-9 | In-gel Trypsin digest |
| Trypsin | Promega | V5111 | In-gel Trypsin digest |
| Protein LoBind Tube 1.5ml | Eppendorf | 22431081 | In-gel Trypsin digest |
| 2mL ROBO vial 9mm | Candian Life Science | VT009/C395SB | In-gel Trypsin digest |
| PP BM insert, No spring | Candian Life Science | 4025P-631 | In-gel Trypsin digest |
References
- Madsen, E. L. Microorganisms and their roles in fundamental biogeochemical cycles. Current opinion in biotechnology. 22 (3), 456-464 (2011).
- El-Swais, H., Dunn, K. A., Bielawski, J. P., Li, W. K. W., Walsh, D. A. Seasonal assemblages and short-lived blooms in coastal northwest Atlantic Ocean bacterioplankton. Environmental microbiology. , (2014).
- Galand, P. E., Potvin, M., Casamayor, E. O., Lovejoy, C. Hydrography shapes bacterial biogeography of the deep Arctic Ocean. The ISME journal. 4 (4), 564-576 (2010).
- Lane, D. J., Pace, B., Olsen, G. J., Stahlt, D. A., Sogint, M. L., Pace, N. R. Rapid determination of 16S ribosomal RNA sequences for phylogenetic analyses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 4972 (1986).
- Williams, T. J., Long, E., et al. A metaproteomic assessment of winter and summer bacterioplankton from Antarctic Peninsula coastal surface waters. The ISME journal. 6 (10), (2012).
- Sheik, C. S., Jain, S., Dick, G. J. Metabolic flexibility of enigmatic SAR324 revealed through metagenomics and metatranscriptomics. Environmental microbiology. 16 (1), 304-317 (2014).
- Venter, J. C., Remington, K., et al. Environmental genome shotgun sequencing of the Sargasso Sea. Science (New York, N.Y.). 304, 66-74 (2004).
- Tyson, G. W., Chapman, J., et al. Community structure and metabolism through reconstruction of microbial genomes from the environment. Nature. 428, 37-43 (2004).
- Schneider, T., Riedel, K. Environmental proteomics: analysis of structure and function of microbial communities. Proteomics. 10 (4), 785-798 (2010).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nature reviews. Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).
- Hettich, R. L., Pan, C., Chourey, K., Giannone, R. J. Metaproteomics: harnessing the power of high performance mass spectrometry to identify the suite of proteins that control metabolic activities in microbial communities. Analytical chemistry. 85 (9), 4203-4214 (2013).
- Von Bergen, M., Jehmlich, N., et al. Insights from quantitative metaproteomics and protein-stable isotope probing into microbial ecology. The ISME journal. 7 (10), 1877-1885 (2013).
- Giovannoni, S. J., Bibbs, L., et al. Proteorhodopsin in the ubiquitous marine bacterium SAR11. Nature. 438 (7064), 82-85 (2005).
- Georges, A. A., El-Swais, H., Craig, S. E., Li, W. K., Walsh, D. A. Metaproteomic analysis of a winter to spring succession in coastal northwest Atlantic Ocean microbial plankton. The ISME journal. , 1-13 (2014).
- Morris, R. M., Nunn, B. L., Frazar, C., Goodlett, D. R., Ting, Y. S., Rocap, G. Comparative metaproteomics reveals ocean-scale shifts in microbial nutrient utilization and energy transduction. The ISME journal. 4 (5), 673-685 (2010).
- Williams, T. J., Cavicchioli, R. Marine metaproteomics: deciphering the microbial metabolic food web. Trends in microbiology. 22 (5), 248-260 (2014).
- Saito, M. a., McIlvin, M. R., et al. Multiple nutrient stresses at intersecting Pacific Ocean biomes detected by protein biomarkers. Science. 345 (6201), 1173-1177 (2014).
- Bertrand, E., Moran, D., McIlvin, M., Hoffman, J., Allen, A., Saito, M. Methionine synthase interreplacement in diatom cultures and communities: Implications for the persistence of B12 use by eukaryotic phytoplankton. Limnology and Oceanography. 58 (4), 1431-1450 (2013).
- Hawley, A. K., Kheirandish, S., et al. Molecular tools for investigating microbial community structure and function in oxygen-deficient marine waters. Methods in enzymology. 531, 305-329 (2013).
- Da Walsh, ., Zaikova, E., Hallam, S. J. Small volume (1-3L) filtration of coastal seawater samples. Journal of visualized experiments: JoVE. (28), 1-2 (2009).
- Thompson, M., Chourey, K. Experimental approach for deep proteome measurements from small-scale microbial biomass samples. Analytical. 80 (24), 9517-9525 (2008).
- Lu, X., Digestion Zhu, H. . Tube-Gel. , 1948-1958 (2005).
- Sharma, R., Dill, B. D., Chourey, K., Shah, M., VerBerkmoes, N. C., Hettich, R. L. Coupling a detergent lysis/cleanup methodology with intact protein fractionation for enhanced proteome characterization. Journal of proteome research. 11 (12), 6008-6018 (2012).
- Santoro, A. E., Dupont, C. L., et al. Genomic and proteomic characterization of “Candidatus Nitrosopelagicus brevis”: An ammonia-oxidizing archaeon from the open ocean. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (4), 1173-1178 (2015).
- Rusch, D. B., Halpern, A. L., et al. The Sorcerer II Global Ocean Sampling expedition: northwest Atlantic through eastern tropical Pacific. PLoS biology. 5 (3), e77 (2007).
- Swan, B. K., Martinez-Garcia, M., et al. Potential for chemolithoautotrophy among ubiquitous bacteria lineages in the dark ocean. Science (New York, N.Y.). 333 (6047), 1296-1300 (2011).
- Rinke, C., Schwientek, P., et al. Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter. Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).
- Saito, M. A., Bulygin, V. V., Moran, D. M., Taylor, C., Scholin, C. Examination of microbial proteome preservation techniques applicable to autonomous environmental sample collection. Frontiers in microbiology. 2, 215 (2011).
- Shevchenko, A., Tomas, J. H., Olsen, J., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856-2860 (2007).
- Thomas, T., Gilbert, J., Meyer, F. Metagenomics – a guide from sampling to data analysis. Microbial Informatics and Experimentation. 2 (1), 3 (2012).
- Huson, D. H., Auch, A. F., Qi, J., Schuster, S. C. MEGAN analysis of metagenomic data. Genome research. 17 (3), 377-3786 (2007).
- Huson, D. H., Mitra, S., Ruscheweyh, H. -. J., Weber, N., Schuster, S. C. Integrative analysis of environmental sequences using MEGAN4. Genome research. 21 (9), 1552-1560 (2011).
- Ea Ottesen, ., Marin, R., et al. Metatranscriptomic analysis of autonomously collected and preserved marine bacterioplankton. The ISME journal. 5 (12), 1881-1895 (2011).
- Feike, J., Jürgens, K., Hollibaugh, J. T., Krüger, S., Jost, G., Labrenz, M. Measuring unbiased metatranscriptomics in suboxic waters of the central Baltic Sea using a new in situ fixation system. The ISME journal. 6 (2), 461-470 (2012).
