Behandlung von Thrombozyten Produkte mit Riboflavin und UV-Licht: Wirksamkeit gegen bakterielle Kontamination mit hohem Titer
Summary
The storage conditions of platelet products create an ideal environment for bacterial contaminants to multiply to dangerous levels. The goal of this study was to use a colony forming assay to evaluate a riboflavin based pathogen reduction process against high titer bacterial contamination in human platelet products.
Abstract
Die Kontamination von Thrombozyten-Einheiten, die durch Bakterien ist seit langem als einer signifikanten Transfusionsrisiko aufgrund ihrer post-Spende Lagerbedingungen anerkannt. Produkte werden routinemäßig bei 22 ° C auf einem Schüttler Schütteln gespeichert, eine Bedingung, die das Bakterienwachstum fördern können. Obwohl die Gesamtzahl der Bakterien angenommen, dass zu einem Blutplättchenprodukt eingebracht werden kann, extrem niedrig ist, können diese Bakterien zu einem sehr hohen Titer vor der Transfusion zu multiplizieren, was möglicherweise zu schwerwiegenden Nebenwirkungen. Das Ziel dieser Studie war es, eine Riboflavin-basierten Pathogen Reduktionsverfahren gegen eine Reihe von Bakterien, die so häufig Verunreinigungen der Thrombozyten Produkte identifiziert wurden, zu bewerten. Dieses Panel umfasste die folgenden Organismen: S. epidermidis, S. aureus, S. mitis, S. pyogenes, S. marcescens, Y. enterocolitica, B. neotomae, B. cereus, E. coli, P. aeruginosa und K. pneumoniae. Jedes Plättchen-Einheit wurde mit einer hohen Keimbelastung impft und Proben wurden b entferntOTH vor und nach der Behandlung. Eine Kolonie-bildenden-Assay unter Verwendung eines Endpunktverdünnungsschema wurde verwendet, um die Vorbehandlung und Nachbehandlung bakteriellen Titer zu bestimmen. Log-Reduktion wurde durch Subtraktion der Nachbehandlung Titer von der Vorbehandlung Titer berechnet. Die folgenden Protokollsenkungen wurden beobachtet: S. epidermidis 4,7 log (99,998%), S. aureus 4,8 log (99,998%), S. mitis 3,7 log (99,98%), S. pyogenes 2,6 log (99,7%), S. marcescens 4,0 log (99,99%), Y. enterocolitica 3,3 log (99,95%), B. neotomae 5,4 log (99,9996%), B. cereus 2,6 log (99,7%), E. coli ≥5.4 log (99,9996%), P. aeruginosa 4,7 log (99,998%) und K . pneumoniae 2,8 log (99,8%). Die Ergebnisse aus dieser Studie deuten darauf hin, das Verfahren könnte dazu beitragen, das Risiko von schweren unerwünschten Transfusionsereignisse mit bakteriellen Kontamination assoziiert zu senken.
Introduction
Transfusion von Blutplättchen, Plasma, gepackte Erythrozyten und Vollblut-Produkte spielen eine wichtige Rolle in der modernen Medizin und kann verwendet werden, um verschiedene Krankheiten zu behandeln, zu ersetzen lebenswichtigen Flüssigkeiten und letztlich Leben retten werden. Blutplättchen sind ein Zellprodukt, das entweder aus Vollblut isoliert und vereinigt in ein transfusable Dosis oder durch den Prozess der Blutplättchen-Apherese gewonnen. Die Hauptaufgabe der Thrombozyten im Körper ist blut an Wundstellen zu stoppen und zur Aufrechterhaltung der Hämostase. Patienten mit einer niedrigen Thrombozytenzellzahl (Thrombozytopenie) sind anfällig für spontane Blutungen und mit Thrombozyten transfundiert zu bringen ihre Thrombozytenzellzahl wieder in einen normalen Bereich. Gesammelten Blutplättchen für maximal 5-7 Tage gelagert und bei 22 ± 2 ° C unter ständigem Rühren gelagert.
Trotz der lebensrettenden Eigenschaften von Thrombozytentransfusionen bleibt ein geringfügiges Risiko für Transfusionsempfänger aufgrund Contamination dieser Produkte durch Parasiten, Bakterien und Viren 11. Die Umsetzung von viralen Nukleinsäuretests (NAT) das Risiko viraler Übertragung von großen Blut getragen Mittel, wie Hepatitis-C-Virus (HCV), Hepatitis-B-Virus (HBV) und menschliches Immunschwächevirus (HIV) signifikant verringert 5. Eine aktuelle Veröffentlichung von den Canadian Blood Services schätzt das Restrisiko für diese Mittel auf 1 pro 8.000.000 Spenden für HIV, 1 je 6,7 Millionen Spenden für HCV und 1 je 1,7 Millionen Spenden für HBV 15 sein.
Obwohl Bakterien typischerweise sammeln weniger Aufmerksamkeit in der Öffentlichkeit hat sich die Frequenz von bakterieller Kontamination in Thrombozytenkonzentraten wurde geschätzt, dass bis zu 1: 1.000 7 und da Millionen von Thrombozytenkonzentraten werden jährlich trans viele Empfänger sind potentiell lebensbedrohliche Komplikationen ausgesetzt wie Sepsis 6. Untersuchungen zeigen, dass die bakterielle Belastung zu dem ZeitpunktKontaminations niedrig ist, <100 koloniebildenden Einheiten (CFU) / product 2,16, aber das nährstoffreiche Umgebung und Lagerung bei Raumtemperatur ermöglicht kontaminierenden Bakterien gefährlich hohen Titern vor der Transfusion zu proliferieren. Derzeit ist die einzige zugelassene Methoden zur Verfügung, um bakteriell kontaminierte Produkte aus einer Thrombozyten Empfänger erreichen zu verhindern, ist die Verwendung von Kultur-basierte Systeme und schnelle Point of Care-Tests. Kurz gesagt, für die Kultur basierten Systemen Thrombozytenprodukte werden auf einem Schüttler bei 22 ° C für 12-24 h auf, dass Bakterien in dem Produkt zu proliferieren, auf dem ein 4-8 ml Probe aus dem Blutplättchenprodukt entfernt und in einer Flasche inokuliert gespeicherten haltigen Nährmedien. Die Flasche wird in ein Instrument, das die Flasche für das Bakterienwachstum überwacht platziert. Erkennt das Gerät, das Bakterienwachstum in der Flasche wird markiert und die entsprechende Thrombozyteneinheit verworfen. Während dieser Prozess recht erfolgreich bei der Erkennung schnell groFlügel Organismen viele der langsam wachsenden Arten nicht auf einen ausreichend hohen Titer wachsen zu erfassen ist, und damit das Potenzial für falsch-negative Einheiten für Trans 7,12,14,16,22 freigegeben. Im Gegensatz zu Kultur Detektionssysteme, schnelle Point of Care-Tests wird in der Regel später in der Thrombozytenlagerzeit durchgeführt, wenn die bakterielle Belastung deutlich erhöht hat. Die höhere Titer erforderlich sind, da point of care-Tests sind weniger empfindlich als die Kultur, die Systeme und Bakterien nur zuverlässig zu detektieren, wenn sie einen Titer ≥1 × 10 3 CFU / ml 17 erreichen. Aber solche Tests liefern Ergebnisse innerhalb von 1 Stunde der Probenahme. Variabilität in der Leistung dieser Tests zur Freisetzung von einem falsch negativen Produkt geführt, was zu einer tödlichen septischen Reaktion im Empfänger 9.
Ein alternativer Weg, um das Problem der bakteriellen Kontamination von Thrombozyten-Produkten zu bekämpfen, ist durch die routinemäßige Verwendung eines Erregerreduzierung process, der anstelle von verunreinigenden Bakterien zu inaktivieren können versuchen, sie zu erkennen. Mit Riboflavin als Photosensibilisator in Kombination mit UV-Licht, wurde gezeigt, dass die Infektiosität von einem breiten Bereich von pathogenen hämatogenen Verunreinigungen zu reduzieren, einschließlich Bakterien 3,4,8,10,19-21 .Verwendung Riboflavin und UV Licht für die Erregerreduzierung ist nicht toxisch und nicht-mutagen, und Riboflavin und UV-Licht behandelten Komponenten sind gezeigt worden, sicher für Transfusionsempfänger als auch für diejenigen, Umgang mit Blutprodukten 18 zu sein. Kurz gesagt, kann Riboflavin Molekülen mit den Nukleinsäuren (DNA und RNA) von Bakterien, Parasiten, Viren und jeder kernhaltigen Zelle (zB weiße Blutzellen) zu verknüpfen. Bestrahlung mit UV-Licht aktiviert Riboflavin, was zu einer chemischen Veränderung, um funktionelle Gruppen der Nukleinsäuren (meist Guaninen), wodurch die Replikation und / oder Transkription der Nukleinsäuren und der Organismus ist inaktiviert 13. Kernlose Zellen wie Platteermöglicht und die roten Blutkörperchen nicht durch die Riboflavin Chemie aufgrund des Fehlens von Nukleinsäure beeinflußt.
Frühere Arbeiten mit Riboflavin und UV-Licht-Technologie evaluiert eine ausgewählte Gruppe von Bakterien mit Hilfe eines experimentellen Design soll ein Blutplättchenprodukt mit einer klinisch relevanten Bakterienlast (<20 KBE / Produkt) 8 verunreinigt zu imitieren. Das Ziel dieser Studie war, die Riboflavin und UV-Licht-Prozess gegen die hohen Titer bakterielle Kontamination zu bewerten (> 1,0 x 10 5 CFU / ml) in Thrombozytenprodukte im Plasma, um zu messen, die Gesamtkeimreduktionskapazität des Systems behandelt. Basierend auf Daten aus Hämovigilanz-Studien 1 gesammelt, wurde eine Gruppe von häufig vorkommenden gram-negative und gram-positive Organismen für die Bewertung in dieser Studie ausgewählt und enthalten die folgenden Arten: Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Streptococcus mitis, Streptococcus pyogenes, Serratia marcescens, Yersinia enterocolitica .Brucella neotomae, Bacillus cereus (vegetative Form), Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa und Klebsiella pneumoniae. Alle Organismen, mit der Ausnahme, B. cereus, wurden von ATCC erhalten und eine Priorität auf den Erhalt Bakterienstämme, die als von Blutbestandteilen getrennt identifiziert worden waren gelegt. Die B. cereus in dieser Studie untersucht ist eine klinische Belastung intern von einem kontaminierten Thrombozytenprodukt isoliert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bakterielle Screening üblich geworden in Blutbanken und für viele Orte es als primäre Methode zur Transfusion von bakteriell kontaminierten Thrombozyten verhindern, dient. Obwohl bakterielle Screening verbietet in der Regel die Mehrheit der schnell wachsenden gramnegativen Bakterien wie S. marcescens, E. coli und E. cloacae, kämpft es um langsam wachsende Gram-positive Bakterien wie S. erkennen aureus, Streptococcus spp. und S. epidermidis 8. Leider sind diese drei Gram-positive Bakterien in nach oben von 50% aller kontaminierten Thrombozyteneinheiten und Transfusion von Blutplättchen-Produkte, die diese drei Organismen verwickelt hat, um Patienten die Sterblichkeit 1 zu führen.
Bakterielle Screening basiert auf dem bakteriellen Titer in einem Blutplättchenprodukt, ausreichend hoch sein, so dass zumindest ein Organismus innerhalb des typischen 4-8 ml Screeningprobe enthaltenen. Wenn die Keim Titer nicht ausreichend hoch ist für ein Bakterium, in dem 4-8 ml Probenvolumen eingefangen werden, ist das Gerät korrekt als negativ gekennzeichnet, und es wird für die Transfusion freigegeben. Ein alternativer Ansatz, um bakterielle Screening könnte sein, einen proaktiven Prozess, der auf allen Thrombozyteneinheiten durchgeführt werden kann, und dass die kontaminierenden Organismen als nicht-funktionale machen könnte zu beschäftigen.
In dieser Studie wurden hohe Titer von Bakterien absichtlich Thrombozyteneinheiten hinzugefügt, um die Gesamtreduktionskapazität des Riboflavin und UV-Licht Erregerreduzierung Prozess zu testen. Obwohl die bakterielle Belastung in dieser Studie getesteten weit über den normalerweise in Blutprodukten bei der Spende fand diese Untersuchung hilft, zeigen, dass das Riboflavin und UV-Licht-Verfahren ist in der Lage, um den Titer von lebensfähigen Bakterien signifikant reduzieren in einem kontaminierten Blutplättcheneinheit 2,6-5,4 log (99,7 bis 99,9996% ige Reduktion der verunreinigenden Bakterien) (Abbildung 2). Um eine Accura erhaltente log Reduktionswert, ist es entscheidend, dass der Bediener eine gute aseptische Technik zusammen mit präzises Pipettieren Fähigkeiten bei der Durchführung der bakteriellen Titer Schritte. Ungenaue Pipettieren bei der Durchführung von Verdünnungsreihen können zu einer Anhäufung von Fehlern und damit zu einer ungenauen Titer Messung führen.
Die in dieser Studie erhobenen Daten unterstützt früheren Arbeiten mit Riboflavin und UV-Licht, die das System vor niedrigem Niveau, klinisch relevante Bakteriämie (<20 KBE / Einheit) in Frage gestellt. Der vorherige Studie wurde entworfen, um eine tatsächliche klinische Kontamination Ereignis zu imitieren, und die Ergebnisse zeigten, Riboflavin und UV-Licht wirksam verhindert Bakterienwachstum über die 7-Tage-Plättchenlagerdauer war. Modellierung auf der Basis der Daten der vorherigen Studie schlägt vor, dass die aktuellen Risikoschätzungen der bakteriellen Kontamination von Blutplättchen Produkte konnten bis zu 98% vom aktuellen Niveau 8 reduziert werden. Die Riboflavin und UV-Licht-Prozess günstig im Vergleich zu bakteriellen Bildschirmtion, die nur eine Wirksamkeit von 66%, bakterielle Verunreinigungen in Thrombozyteneinheiten erfassen, wenn mit einer klinisch relevanten Bakterienlast 8 gefordert demonstriert.
Wie bei allen Technologien, PRT Behandlung von Thrombozytenprodukte zu Komplikationen mit bakteriell kontaminierten Thrombozyten-Einheiten hat ihre Grenzen vermieden werden. PRT Systeme sind nicht wirksam gegen bakterielle Sporen und nicht inaktivieren Endotoxin, wodurch, selbst wenn ein PRT System kann hohe Titer von Gram-negativen Bakterien zu inaktivieren, die verbleibende Endotoxin noch im Empfänger verursachen septischem Schock. PRT wird am besten früh während der Lagerung durchgeführt, bevor die Bakterien, um hohe Titer zu propagieren.
Abschließend, wie durch die Kombination dieser beiden Studien gezeigt haben, ist das Riboflavin und UV-Licht-Prozess effektiv bei der Reduzierung der bakteriellen Belastung sowohl gegenüber gramnegativen und grampositiven Organismen und eine praktikable Alternative zu bakteriellen Abschirmung bieten. Routinemäßig treating Thrombozytenkonzentraten mit Riboflavin und UV-Licht hat den zusätzlichen Vorteil, dass der potentielle Übertragung von anderen Blut übertragbaren Agenzien wie Viren und Parasiten.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Mirasol Illuminator | Terumo BCT | N/A | |
| Mirasol Treatment/Storage Bag | Terumo BCT | N/A | |
| Hematology Analyzer | Beckman-Coulter | Ac•T diff | |
| Blood Gas Analyzer | Siemens | RapidLab 1265 | |
| Sterile Docking Device | Terumo BCT | TSCD | |
| Platelet Incubator | Helmer | PC2200 | |
| Orbital Incubator Shaker | Lab-Line | 4628 | |
| Dry Incubator | Fisher | Iso-temp | |
| Class II A/B3 Biosafety Cabinet | Thermo-forma | 1286 | |
| Tubing Sealer | Sebra | Smart Sealer II | |
| Table Top Centrifuge | IEC | Centra GP8R | |
| 10 mL Syringe | BD | 309604 | |
| 30 mL Syringe | BD | 309650 | |
| 5 mL Dilution Tube | VWR | 211-0058 | |
| 50 mL Conical Tube | Corning | 430290 | |
| Micropipette | Gilson | P-200 | |
| Micropipette | Rainin | R-200 | |
| Repeat Pipette | Eppendorf | 4780 | |
| 1-200 µL Filter Tip | Costar | 4810 | |
| 25 mL Disposable Serrological Pipette | Costar | 4489 | |
| 5 mL Disposable Serrological Pipette | Costar | 4487 | |
| 35 mL 500 µM Riboflavin | Terumo BCT | 35 mL 500 µM | |
| Brucella Agar with 5% Horse Blood | BBL | 221547 | |
| Brain Heart Infusion | Teknova | B9993 | |
| Peptone Water | BD | 257087 | |
| Trypticase Soy Broth | BD | 299113 | |
| Trypticase Soy Agar | Remel | R01917 | |
| Heat Inactivated Horse Serum | Gibco | 26050 |
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