ラットヘッドBranchiomeric筋肉から衛星細胞の単離とキャラクタリゼーション

本明細書に記載の全ての実験は、オランダの法律および規制（RU-DEC 2013から205）に応じてラートボウト大学ナイメーヘンから動物実験のために地元の理事会で承認されました。 1.細胞外マトリックスゲルスポット分離前に1日以下の手順を実行します。 少なくとも1.5時間、4℃で一定分量外マトリックスゲル（100μl）を解凍します。ダルベッコ改変イーグル培地中で1:10に希釈し、 4,500 mg / Lのグルコース、4mMのL-グルタミン、および110 mg / mlのピ​​ルビン酸ナトリウム（DMEM）を有します。すべての回で4℃での細胞外マトリックスゲルを保管してください。注：急激な温度変化が塗布ムラや結晶形成をもたらします。 15分間氷上で希釈された細胞外マトリックスゲル溶液を保管してください。 10分間、20μlのマイクロピペットを事前に冷やし。 100ミリメートルペトリ皿に8ウェルチャンバースライドを入れ、10分間冷表面（ 例えばフリーザーパック）上に皿を転送します。各ウェルに10μlの細胞外マトリックスゲルのドロップを入れて予備冷却マイクロピペットを使用してください。少なくとも他7分（ 図1A）、冷表面にペトリ皿にしてください。 完全に残っている細胞外マトリックスゲル（ 図1B）を削除し、37℃で一晩、ウェルを乾燥させます。 2.解剖頭の筋肉（咬筋、顎二腹筋、及び挙ヴェリ口蓋） 切開の前に、2％のペニシリン – ストレプトマイシン（P / S）を補充したリン酸緩衝生理食塩水（PBS）50mlのを準備します。氷の上に保管してください。 CO 2 / O 2と一人の若い成体ラット（9週）の安楽死の後、頭を刎ねると頭から皮膚を削除します。氷冷PBSにヘッドを移すを50mlチューブ中の2％P / Sを補充しました。 （第1鰓弓由来）咬筋シリコンパッド上の一側を上に頭を置き、皮下Nで固定eedles（ 図2A）。 耳下腺および顔面神経（ 図2A）を特定します。腺を覆う深い筋膜を露出させます。筋膜をカットし、解剖ハサミを使用して腺を削除します。外耳道を識別します。茎乳突孔から顔面神経をトレースし、慎重に手術用メスの刃の第15号で、時間的な頬骨と頬枝を削除します。 筋膜を除去することによって咬筋の表面的な頭を解放します。咬筋の表面と深部の両方のヘッドを特定します。上顎の頬骨突起に挿入されたその太い腱腱膜まで表面的なヘッドをトレースします。 ストレートピンセットで頬骨突起を原点から腱を分離します。手術用メスの刃15号や解剖ハサミでそれをカットし、慎重に生活して（ 図2B）。 その角度で挿入し、Tの下半分まで咬筋の表面的な頭を解剖彼は手術用メスの刃番15（ 図2C）と下顎の枝の表面を横。今、完全に筋肉を削除します。 （ 第 2鰓弓由来）二腹筋の後方腹シリコンパッド上に仰臥位で頭部を置き、皮下注射針（ 図3A）で固定します。 舌下および顎下腺の両方の上に位置する皮下脂肪を除去します。次に、表在性筋膜と解剖ハサミを使用して腺を削除します。二腹筋（前方および後方腹）を公開します。 ストレートピンセットで後方腹の前腱を持ち、それをカットし、鼓室胞（ 図3B）にその起源まで慎重に解剖。反対側で同じ操作を行います。 （第4鰓弓由来）口蓋帆挙筋筋二腹筋の後方腹の切開後の（ 図4A）、横方向に引き、そして慎重に取り外し、茎突舌骨筋をローカライズ。 鼓膜胞（ 図4A）で挿入口蓋帆挙筋の腱をローカライズ。慎重にそれを分析し、両側にそれをカット。 気管およびその背後に実行食道を探します。食道を持ち上げ、咽頭、喉頭および軟口蓋を公開します。 口蓋帆挙筋が挿入された軟口蓋の領域を局所化した（ 図4B）緩いそれをカット。 注：直接切開した後、慎重に実体顕微鏡下で各筋肉の腱および結合組織を除去します。エタノール70％に迅速に全ての検体を水没し、氷冷PBSに転送15mlチューブに2％P / Sを加えたもの。 衛星細胞の単離3 筋肉の3つのグループからのSC単離するための以下の製造手順を実行します。 DMEM中の0.1％プロナーゼの7.5ミリリットルを準備します。 0.22μmのフィルターを通してソリューションをフィルタリングします。分離前に10分間、水浴中で37℃で溶液を事前に温めます。 準備、10％ウマ血清（HS）および1％P / Sを添加したDMEMの35ミリリットル。また、事前に暖かい37℃の水浴中。 20％ウシ胎児血清（FBS）、10％HS、1％P / S、1％ニワトリ胚抽出物（CEE）を添加したDMEMから成る15ミリリットルの培地を調製します。水浴中で37℃でのプレ暖かいです。 プレコート6プラスチックピペット使用前に少なくとも10分間、HSと（10ml）および乾燥。 培養フードでは、6ウェルプレートのウェルに各筋肉を転送します。解剖ハサミを使用して、約2mmの小片に筋を切りました。あまりにも多くの組織をミンチしないように注意してください。 慎重に各ウェルに0.1％のプロナーゼ溶液を2.5ミリリットルを追加し、37℃で60分間インキュベートします。静かに20、40、および60分後にプレートを横に振ります。注：正確なduratioインキュベーションのNは、動物の年齢や歪みなどの要因に依存します。 顕微鏡下で監視します。筋肉の断片を確認し、繊維束が緩ん外観（ 図5）を取得するときに、酵素消化を停止します。 DMEM 2.5mlの10％HSおよび1％P / Sを補充した追加。 5分間400×gで15ミリリットルチューブと遠心分離機にチューブを転送します。デカンテーションにより上澄み液を捨てます。 10％HSおよび1％P / Sを補充した5ミリリットルのDMEMを追加します。溶液をピペットで上下10ミリリットルのプラスチックピペット（トリチュレーション）で組織を均質化するために、少なくとも20回。 4分間200×gでチューブを遠心。上清を回収し、15 mlチューブに移します。 10％HSおよび1％P / Sを補充した5ミリリットルのDMEMを追加します。 10ミリリットルのプラスチックピペットを用いて、再びピペット組織断片をピペットを介して容易に通過するまで。 4分間200×gでチューブを遠心し、15mlチューブ内の上清を収集します。 P50mlのチューブにセルストレーナー（40μm）をユタ、フィルター上に解離した細胞を含む上清を移します。最大の細胞回収のために1ミリリットルのDMEMで洗浄しました。 10分1,000×gでチューブを遠心し、ピペットで上清を捨てます。 300μlの培養液中にペレットを再懸濁し、血球計で細胞をカウントします。 細胞外マトリックスゲルスポットの衛星細胞の分化4 培地10μl中1.5×10 3個の細胞を得るために、細胞懸濁液を希釈します。 テープでチャンバースライドのカバーを固定して、オブジェクトのガラスの下側に黒のマ​​ーカーでスポットをマークします。 マイクロピペットを使用して、細胞外マトリックスゲルスポットに10μlの細胞懸濁液の液滴を置きます。細胞懸濁液の低下がその場で正しく配置されているかどうかを顕微鏡で確認してください。 37℃で6時間インキュベートします。 注意深いですLYは、培養培地（20％FBSを補充したDMEM、10％HS、1％P / S、1％CEE）の400μlを添加し、37℃で3日間インキュベートします。 注：この時点では、新たに単離されたSCは、大規模な外傷（酵素消化および過酷なトリチュレーション）にかけ、彼らが回復する必要があります。第三日37時の次に細胞を乱さないで、培養培地は、実験の種類に応じて変更することができます。 細胞外マトリックスゲルスポットを分化アッセイのための高細胞密度（1.5〜2.5×10 20分の3μL）を播種することができます。培養媒体（DMEM、20％FBS、10％HS、1％P / S、1％ニワトリ胚抽出物を補充した）三日毎に交換することができます。 あるいは、拡張および通過を希望する場合は、次の手順に従います。 少なくとも1.5時間、4℃で一定分量外マトリックスゲル（500μl）を解凍します。 DMEM中で1:10に希釈し、ポイント1.1.1の推奨事項に従ってください。 4で10分間プレ寒10ミリリットルピペット＆＃176; C。 10分間の冷表面（ 例えばフリーザーパック）に3 T75フラスコを転送します。 各フラスコに1ミリリットルの細胞外マトリックスゲルを入れて予備冷却したピペットを使用してください。表面が完全に覆われていることを確認してください。少なくとも他7分（ 図1A）、冷表面にフラスコを保管してください。 完全に10ミリリットルピペットで残っている細胞外マトリックスゲルを除去し、37℃で1時間、ウェルを乾燥させます。 カウントした後、培養培地を予め被覆T75フラスコおよびシード（20％FBS、10％HS、1％P / S、1％ニワトリ胚抽出物を補充したDMEM）10ml中の新たに単離したのSCを再懸濁します。 80％のコンフルエンスに到達するまで、3日後、培地（と3日ごと）に変更します。継代のために、PBSでT75フラスコを3回洗浄します。次に1ミリリットルを、0.25％トリプシン溶液を添加し、37℃で3分間インキュベートします。培地9mlの再懸濁は（DMEM、10％HS、1％P / S、20％FBSを補充し1％ニワトリ胚抽出物）と5分間、200×gで遠心します。上清を捨てます。カウントした後、培地1000μlの1×10 6細胞を再懸濁し、細胞を凍結します。