Isolierung und Charakterisierung von Satellitenzellen aus Ratte Kopf Branchiomeric Muscles

Alle hierin beschriebenen Experimente wurden von den lokalen Vorstand für Tierversuche von der Radboud Universität Nijmegen in Übereinstimmung mit niederländischen Gesetzen und Vorschriften (RU-DEC 2013-205) zugelassen. 1. extrazellulären Matrix-Gel-Spots Die folgenden Schritte werden einen Tag vor der Trennung: Auftauen eines Aliquots der extrazellulären Matrix-Gel (100 ul) bei 4 ° C für mindestens 1,5 Std. 1:10 verdünnen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium; 4.500 mg / l Glucose, 4 mM L-Glutamin und 110 mg / ml Natriumpyruvat (DMEM). Halten die extrazelluläre Matrix-Gel bei 4 ° C zu allen Zeiten. Hinweis: Plötzliche Temperaturänderungen werden in ungleichmäßigen Beschichtung und Kristallbildung führen. Halten Sie das verdünnt extrazellulären Matrix-Gel-Lösung auf Eis für 15 min. Pre-Chillen ein 20 & mgr; l-Mikropipette für 10 min. Legen Sie 8-Well-Kammer-Objektträgern in eine 100 mm Petrischale und übertragen Sie die Schale auf eine kalte Oberfläche (zB ein Kühlakku) für 10 min. Verwenden Sie das vorgekühlte Mikropipette einen Tropfen von 10 ul der extrazellulären Matrix-Gel in jede Vertiefung setzen. Halten Sie die Petrischale auf der kalten Oberfläche für mindestens einen weiteren 7 min (Abbildung 1A). Vollständig zu entfernen, die verbleibenden extrazellulären Matrix-Gel (1B), und trocknen Sie die Vertiefungen bei 37 ° C über Nacht. 2. Dissection der Hauptmuskeln (Masseter, digastricus und Levator veli palatini) Vor ihrer Zerlegung, bereiten 50 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) mit 2% Penicillin-Streptomycin (P / S) ergänzt. Halten Sie auf dem Eis. Nach Euthanasie eines jungen erwachsenen Ratten (9 Wochen) mit CO 2 / O 2, enthaupten den Kopf und entfernen Sie die Haut vom Kopf. Übertragen Sie den Kopf, um eiskaltem PBS, ergänzt mit 2% P / S in ein 50 ml Röhrchen. M. masseter (von der 1. Kiemenbogens abgeleitet) Platzieren Sie den Kopf mit einer Seite auf einem Silikon-Pad und befestigen mit Injektions needles (2A). Identifizieren Sie die Ohrspeicheldrüse und der Gesichtsnerven (2A). Setzen Sie die tiefe Faszie Abdecken der Drüse. Schneiden Sie die Blende und entfernen Sie die Verschraubung mit Dissektion Schere. Identifizieren Sie den äußeren Gehörgang. Verfolgen Sie die Gesichtsnerven von den Foramen stylomastoideum und entfernen Sie vorsichtig die zeitlichen, Jochbein und Wangen Zweige mit einer Skalpellklinge No. 15. Befreie die oberflächliche Kopf des M. masseter durch Entfernen der Blende. Identifizieren sowohl oberflächliche und tiefe Köpfe des M. masseter. Verfolgen Sie die oberflächliche Kopf, bis seine dicken Sehnen Aponeurose in den Processus zygomaticus der Maxilla eingesetzt. Trennen Sie die Sehne von seinem Ursprung am Jochbein mit einer geraden Pinzette. Schneiden Sie es mit einer Skalpellklinge No. 15 oder Dissektion Schere und sorgfältig Leben es (2B). Präparieren Sie die oberflächliche Kopf der masseter, bis seine Einführung am Winkel und schlechtere Hälfte ter Mantelfläche des Ramus des Unterkiefers mit einer Skalpellklinge No. 15 (Abbildung 2C). Nun, ganz den Muskel zu entfernen. Hintere Bauch des M. digastricus (aus der 2. Kiemenbogen abgeleitet) Platzieren Sie den Kopf in Rückenlage auf dem Silikon-Pad und befestigen mit Injektionsnadeln (3A). Entfernen Sie das Unterhautfett, die über beide sublingual und submandibularis. Dann entfernen Sie den oberflächliche Faszie und Drüsen mit Dissektion Schere. Setzen Sie den M. digastricus (vordere und hintere Bauch). Halten Sie den vorderen Sehne des hinteren Bauch mit einem geraden Pinzette, schneiden Sie es, und sezieren sie vorsichtig, bis seinen Ursprung in der Bulla tympanica (3B). Wiederholen Sie den Vorgang auf der Gegenseite. Levator veli palatini Muskel (ab dem 4. Kiemenbogen abgeleitet) Nach Präparation der hintere Bauch des M. digastricus, Lokalisieren M. stylohyoideus, ziehen Sie es seitlich, und ziehen Sie sie vorsichtig (4A). Lokalisieren Sie die Sehne des Levator veli palatini, die an der Bulla tympanica (4A) einfügt. Sezieren sie sorgfältig und schneiden Sie es auf beiden Seiten. Suchen Sie nach der Luftröhre und der Speiseröhre, die dahinter läuft. Heben Sie die Speiseröhre, und setzen die Rachen, Kehlkopf und den weichen Gaumen. Lokalisieren Sie den Bereich des weichen Gaumens, wo die levator veli palatini eingesetzt und schneiden Sie es lose (4B). Hinweis: Direkt nach der Sektion, entfernen Sie vorsichtig Sehnen und Bindegewebe aus jeder Muskel unter dem Stereomikroskop. Tauchen Sie alle Proben schnell in Ethanol 70%, und sie auf eiskaltem PBS ergänzt 2% P / S in einem 15-ml-Tube. 3. Isolierung von Satelliten-Zellen Führen Sie die folgenden Vorbereitungsschritte für SC Isolation von 3 Muskelgruppen: Vorbereitung 7,5 ml 0,1% Pronase in DMEM. Die Lösung wird durch ein 0,22 um-Filter. Vorwärmen der Lösung bei 37 ° C in einem Wasserbad für 10 min vor der Isolierung. Vorbereitung 35 ml DMEM mit 10% Pferdeserum (HS) und 1% P / S ergänzt. Auch vor, eine warme bei 37 ° C im Wasserbad. Vorbereitung 15 ml Kulturmedium, das aus DMEM, ergänzt mit 20% fötalem Rinderserum (FBS), 10% HS, 1% P / S und 1% Hühnerembryoextrakt (CEE). Pre-warmen bei 37 ° C im Wasserbad. Vorstrich sechs Plastikpipetten (10 ml) mit HS und trocken für mindestens 10 min vor dem Gebrauch. In der Kultur Haube, übertragen jeden Muskel in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte. Mit Hilfe der Dissektion Schere, schnitt die Muskeln in kleine Stücke von etwa 2 mm. Achten Sie darauf, um das Gewebe zu viel Blatt vor den Mund. 2,5 ml 0,1% Pronase-Lösung sorgfältig auf jede weitere gut und bei 37 ° C für 60 min. Die Platte Schütteln Sie nach 20, 40 und 60 min. Hinweis: Die genaue duration der Inkubation ist abhängig von Faktoren wie Alter und Belastung der Tiere. Überwachung unter dem Mikroskop. Überprüfen Sie die Muskelfragmente und stoppen die enzymatische Verdauung, wenn die Fasern Bündel einen gelockerten Aussehen (Abbildung 5). Hinzuzufügen 2,5 ml DMEM, ergänzt mit 10% HS und 1% P / S. Transfer in ein 15 ml Zentrifugenrohr und die Rohre bei 400 xg für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand durch Dekantieren. 5 ml DMEM mit 10% HS und 1% P / S ergänzt. Pipettieren der Lösung nach oben und unten mit einer 10 ml Kunststoffpipette (Verreibung) für mindestens 20 Mal, um das Gewebe zu homogenisieren. Zentrifugieren der Röhren bei 200 g für 4 min. Sammeln Sie den Überstand und Überführung in eine 15-ml-Tube. 5 ml DMEM mit 10% HS und 1% P / S ergänzt. Pipette wieder mit einer 10 ml Kunststoffpipette bis die Gewebefragmente verläuft leicht durch die Pipette. Zentrifugieren der Röhren bei 200 g für 4 min und sammle den Überstand in ein 15 ml Röhrchen. Put eine Zelle Sieb (40 & mgr; m) auf ein 50-ml-Tube und den Überstand, der die dissoziierten Zellen auf den Filter. Mit 1 ml DMEM für maximale Erholung der Zellen zu waschen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 1.000 × g für 10 min und den Überstand verwerfen mit einer Pipette. Das Pellet in 300 ul Kulturmedium und zähle die Zellen in einem Hämocytometer. 4. Differenzierung von Satellitenzellen auf extrazellulären Matrix-Gel-Spots Verdünne die Zellsuspension auf 1.5 x 10 3 Zellen in 10 ul Kulturmedium zu erhalten. Die Abdeckungen der Kammern Folien mit Klebeband und markieren Sie die Stellen mit einem schwarzen Marker auf der Unterseite des Objektglas. Mit einer Mikropipette, einen Tropfen von 10 ul Zellsuspension auf die extrazelluläre Matrix-Gel vor Ort. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die Tropfen Zellsuspension korrekt auf der Stelle platziert. Inkubieren für 6 Stunden bei 37 ° C. Vorsichtigly werden 400 ul Kulturmedium (DMEM mit 20% FBS, 10% HS, 1% P / S und 1% CEE) und Inkubation für drei Tage bei 37 ° C. Hinweis: An dieser Stelle werden frisch isolierten SC zu massiven Trauma (enzymatischer Verdau und harte Verreiben) unterzogen und sie wiederherstellen müssen. Während der ersten drei Tage 37. Weiter die Zellen nicht stören, kann das Kulturmedium in Abhängigkeit von der Art des Experiments geändert werden. Die extrazelluläre Matrix Gelflecken mit hoher Zelldichte (1,5-2,5 x 10 3/20 ul) für die Differenzierung Assay ausgesät werden. Kulturmedium (DMEM, ergänzt mit 20% FBS, 10% HS, 1% P / S und 1% Hühnerembryoextrakt) kann alle drei Tage ausgetauscht werden. Alternativ, wenn Erweiterung und Weitergabe ist erwünscht, befolgen Sie bitte folgende Schritte: Auftauen eines Aliquots der extrazellulären Matrix-Gel (500 ul) bei 4 ° C für mindestens 1,5 Std. Verdünnen 1:10 in DMEM und folgen Sie den Empfehlungen in Ziffer 1.1.1. Pre-Chill eine 10 ml Pipette für 10 Minuten bei 4 &# 176; C. Bringen Sie drei T75-Kolben auf eine kalte Oberfläche (zB ein Kühlakku) für 10 min. Verwenden Sie das vorgekühlte Pipette 1 ml extrazellulären Matrix Gel in jedem Kolben gegeben. Überprüfen Sie, dass die Oberfläche vollständig bedeckt ist. Halten Sie die Flaschen auf der kalten Oberfläche für mindestens einen weiteren 7 min (Abbildung 1A). Vollständig zu entfernen, die verbleibenden extrazellulären Matrix-Gel mit einer 10 ml Pipette, und trocknen Sie die Vertiefungen bei 37 ° C für 1 Stunde. Nach dem Zählen resuspendieren frisch isolierten SCs in 10 ml Kulturmedium (DMEM mit 20% FBS, 10% HS, 1% P / S und 1% Hühnerembryoextrakt) ergänzt und in den Samen vorbeschichtet T75-Flaschen. Nach drei Tagen, ändern Sie das Medium (und jeden dritten Tag), bis 80% Konfluenz erreicht ist. Für Passagieren, waschen Sie die T75-Kolben dreimal mit PBS. Next 1 ml 0,25% Trypsin-Lösung und Inkubation für drei Minuten bei 37 ° C. Resuspendieren in 9 ml Kulturmedium (DMEM, supplementiert mit 20% FBS, 10% HS, 1% P / Sund 1% Hühnerembryoextrakt) und zentrifugiert bei 200 g für 5 min. Überstand verwerfen. Nach dem Zählen resuspendieren 1 x 10 6 Zellen in 1000 ul des Kulturmediums und Einfrieren der Zellen.