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Developmental Biology

L'isolement et la caractérisation des cellules satellites de Muscles Rat chef Branchiomeric

Published: July 20, 2015
doi:
10.3791/52802
, , , , ,
1Department of Orthodontics and Craniofacial Biology, Radboud Institute for Molecular Life Sciences,Radboud University Medical Center, 2Department of Biological Structure,University of Washington School of Medicine, 3Department of Biochemistry, Radboud Institute for Molecular Life Sciences,Radboud University Medical Center

Summary

Ce protocole décrit l'isolement de cellules satellites de muscles de la tête branchiomeric d'un rat âgé de 9 semaines. Les muscles proviennent de différents arcs branchiaux. Par la suite, les cellules satellites sont cultivées sur une couche de tache de taille millimétrique pour étudier leur différenciation. Cette approche permet d'éviter l'expansion des passages et des cellules satellites.

Abstract

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent problems in speech, swallowing, and sucking. In vitro culture systems that allow the study of satellite cells (myogenic stem cells) from head muscles are crucial to develop new therapies based on tissue engineering to promote muscle regeneration after surgery. These systems will offer new perspectives for the treatment of cleft palate patients. A protocol for the isolation, culture and differentiation of satellite cells from head muscles is presented. The isolation is based on enzymatic digestion and trituration to release the satellite cells. In addition, this protocol comprises an innovative method using extracellular matrix gel coatings of millimeter size, which requires only low numbers of satellite cells for differentiation assays.

Introduction

Environ 1: 500 à 1: 1 000 nouveau-nés présentent une fente impliquant la lèvre et / ou palatine (CLP); donc ceci est la malformation congénitale la plus fréquente chez l'homme 1. Les muscles du palais mou sont essentiels pour le fonctionnement du palais mou pendant le discours, la déglutition et de succion. Si une fissure du palais mou est présent, ces muscles sont anormalement insérés dans l'extrémité postérieure de l'os palatin.

Le palais mou monte et descend pendant le discours, empêchant l'air de sortir par le nez. Les enfants ayant une fente dans le palais ne disposent pas de cette fonction de contrôle résultant d'un phénomène connu comme la dysfonction vélopharyngée 2,3. Bien que les protocoles de traitement sont variables, la réparation chirurgicale du palais mou se déroule dans la petite enfance (6-36 mois) 4. Les muscles anormalement insérées du palais mou peuvent être corrigées chirurgicalement 5-7, cependant, la dysfonction vélopharyngée persiste dans 7% à 30%des patients 2,3,8-10.

La capacité des muscles squelettiques à régénérer par l'action des cellules satellites (SCS) est bien établi 11,12. Sur blessure musculaire, SC sont activés et migrent vers le site de la lésion. Ils ont ensuite prolifèrent, se différencient, et fusionnent pour former de nouvelles fibres musculaires ou réparation endommagé les 13. Centres de repos expriment le facteur de transcription Pax7 14,15, tandis que leur descendance, les myoblastes en prolifération, d'exprimer en outre le facteur de détermination myogénique 1 (MyoD) 16. Myoblastes Différencier commencent à exprimer myogénine (MyoG) 17. La différenciation terminale des myoblastes est marquée par la formation de fibres musculaires, et l'expression de protéines spécifiques du muscle tels que la myosine chaîne lourde (MyHC) 16,18.

Récemment, plusieurs stratégies ont été utilisées dans la médecine régénérative pour améliorer la régénération musculaire des muscles des membres 19-23. Des études spécifiques surles muscles de la tête branchiomeric sont également importants, car il a été récemment démontré qu'ils diffèrent des autres muscles dans plusieurs aspects 24. Par contraste avec les muscles des membres, il a été suggéré que les muscles de la tête branchiomeric contiennent moins de Centres 25, régénèrent plus lent, et le tissu conjonctif plus fibreuse est formée après la lésion 26 En outre, la prolifération des Centres de muscles de la tête branchiomeric exprimer également d'autres facteurs de transcription. Par exemple, Tcf21, un facteur de transcription pour la formation des muscles cranio-faciale est fortement exprimé dans la régénération des muscles de la tête mais à peine dans la régénération de muscles des membres 25. Les muscles du palais mou des patients CLP sont généralement plus petites et moins bien organisée rapport aux muscles palatins normales 27,28. Les fibres lentes et rapides sont tous deux présents dans les muscles du voile du palais, mais les fibres lentes sont plus abondantes. En revanche, les muscles fendus contiennent une proportion élevée de fibres rapides et également une alimentation capillaire réduitpar rapport aux muscles du voile du palais normales 29-31. Les fibres rapides sont plus vulnérables aux blessures contraction induite 31-33. L'alimentation capillaire pauvres d'accompagnement peut également favoriser la fibrose 34,35. Tous ces aspects peuvent contribuer à la mauvaise régénération des muscles du voile du palais après la fermeture chirurgicale fente 36. Dans cette perspective, un protocole pour l'isolement et la caractérisation de branchiomeric tête musculaire SC est crucial. Cela donne la possibilité d'étudier la biologie des muscles SC tête branchiomeric. En outre, de nouvelles thérapies basées sur l'ingénierie tissulaire peuvent être développés pour favoriser la régénération musculaire après la chirurgie dans le CLP et d'autres conditions compromettant la région craniofaciale.

En général, les Centres peuvent être obtenus après dissociation du tissu musculaire 14. Mincing, digestion enzymatique, et la trituration sont généralement tenus de libérer SC de leur niche. SC peut être purifié par pré-placage non revêtues sur des boîtes 14,37,38, fractionation sur Percoll 39,40, une cellule ou fluorescent- ou tri magnétique 41-43. Ici, nous présentons un nouveau protocole économique et rapide pour l'isolement des cellules satellites des muscles de la tête branchiomeric de jeunes rats adultes. Ce protocole est basé sur un manuscrit précédent 14 et spécifiquement adaptée pour de petits échantillons de tissu. L'isolement des Centres de muscles représentatifs provenant de la 1 ère, 2 ème et 4 ème arcs branchiaux sont décrits. Après isolement, un faible nombre de cellules satellites sont mises en culture sur des taches de gel extracellulaires de matrice de taille millimétrique pour étudier leur différenciation. Cette approche évite la nécessité pour l'expansion et passages de SC.

Protocol

Toutes les expériences décrites ici ont été approuvés par le conseil local pour l'expérimentation animale de l'Université Radboud de Nimègue, conformément aux lois et règlements (RU par DEC 2013-205) néerlandais. 1. Spots Gel matrice extracellulaire Effectuez les étapes suivantes un jour avant l'isolement: Décongeler un gel de matrice extracellulaire aliquote (100 ul) à 4 ° C pendant au moins 1,5 h. Diluer au 1/10 dans du milieu de Eagle modifié par Dulbecco; avec 4,500 mg / L de glucose, 4 mM de L-glutamine et 110 mg / ml de pyruvate de sodium (DMEM). Conserver le gel de la matrice extracellulaire à 4 ° C en permanence. Remarque: Les changements de température brusques se traduira par revêtement inégal et la formation de cristaux. Conserver la solution de gel de matrice extracellulaire dilué sur la glace pendant 15 min. Pré-refroidir une micropipette de 20 ul pendant 10 min. Mettez les diapositives de la chambre 8 puits dans une boîte de Pétri de 100 mm et de transférer le plat sur ​​une surface froide (par exemple une poche de congélation) pendant 10 min. Utilisez la micropipette pré-refroidi à mettre une goutte de 10 ul gel de la matrice extracellulaire dans chaque puits. Gardez la boîte de Pétri sur la surface froide pendant au moins une autre 7 min (figure 1A). Supprimer complètement le reste de gel de la matrice extracellulaire (figure 1B), et sécher les puits à 37 ° C pendant la nuit. 2. Dissection de chef Muscles (masséters, digastriques et muscle élévateur du voile du palais) Avant de dissection, de préparer 50 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) additionné de 2% de pénicilline-streptomycine (P / S). Garder sur la glace. Après l'euthanasie d'un jeune rat adulte (9 semaines) avec CO 2 / O 2, décapiter la tête et enlever la peau de la tête. Transférer la tête pour PBS glacé additionné de 2% P / S dans un tube de 50 ml. Muscle masséter (dérivé du 1er arc branchial) Placez la tête avec un côté sur un tampon de silicone et fixer avec hypodermique needles (figure 2A). Identifier la glande parotide et du nerf facial (figure 2A). Exposer l'aponévrose recouvrant la glande. Couper le fascia et enlever la glande à l'aide des ciseaux de dissection. Identifier le conduit auditif externe. Tracez le nerf facial du foramen stylomastoïdien et retirer délicatement les branches temporelles, zygomatiques, et buccale avec une lame scalpel n ° 15. Libérez la tête superficielle du muscle masséter en enlevant le fascia. Identifier les têtes à la fois superficielles et profondes du muscle masséter. Trace la tête superficielle jusqu'à son aponévrose épaisse tendineux inséré dans le processus zygomatique du maxillaire. Séparer le tendon de son origine au processus zygomatique avec une pince droites. Couper avec une lame de bistouri n ° 15 ou des ciseaux de dissection et soigneusement vie, il (figure 2B). Disséquer la tête superficielle du masséter jusqu'à son insertion à l'angle et la moitié inférieure de la til surface latérale du ramus de la mandibule avec une lame de scalpel n ° 15 (figure 2C). Maintenant, supprimer complètement le muscle. Ventre postérieur du muscle digastrique (dérivé de l'arc 2 ème branchiale) Placez la tête dans une position couchée sur le pad de silicone et le fixer avec des aiguilles hypodermiques (figure 3A). Retirez la graisse sous-cutanée recouvrant à la fois par voie sublinguale et de glandes sous-maxillaires. Ensuite, retirez la façade et les glandes avec des ciseaux de dissection superficielle. Exposer le muscle digastrique (antérieure et postérieure du ventre). Maintenez le tendon antérieur du ventre postérieur avec une pince droites, couper, et disséquer avec soin jusqu'à son origine dans la bulle tympanique (figure 3B). Faites la même chose sur le côté controlatéral. Muscle élévateur du voile du palais musculaire (dérivé de l'arc branchial 4e) Après dissection du ventre postérieur du digastrique, Localiser le muscle stylohyoïdien, tirez latéralement, et retirez soigneusement (figure 4A). Localisez le tendon du voile du palais du releveur qui insère à la bulle tympanique (figure 4A). Disséquer soigneusement et couper des deux côtés. Cherchez la trachée et l'œsophage qui passe derrière elle. Soulevez l'œsophage, et exposer le pharynx, du larynx et le palais mou. Localisez la zone du voile du palais où le palatini releveur du voile est inséré et le couper en vrac (figure 4B). Remarque: Directement après dissection, retirez soigneusement tendon et le tissu conjonctif de chaque muscle sous le microscope stéréo. Immerger rapidement tous les échantillons dans de l'éthanol 70%, et les transférer sur PBS glacé complété 2% P / S dans un tube de 15 ml. 3. Isolement des cellules satellites Effectuez les étapes suivantes de préparation pour SC isolement de 3 groupes de muscles: Préparer 7,5 ml de pronase à 0,1% dans du DMEM. Filtrer la solution à travers un filtre de 0,22 um. Préchauffer la solution à 37 ° C dans un bain d'eau pendant 10 minutes avant l'isolement. Préparer 35 ml de DMEM supplémenté avec 10% de sérum de cheval (HS) et de 1% P / S. En outre préchauffer à 37 ° C dans un bain d'eau. Préparer 15 ml de milieu de culture constitué de DMEM complété avec 20% de sérum bovin fœtal (FBS), 10% de HS, 1% P / S et 1% d'extrait d'embryon de poulet (CEE). Pré-chaude à 37 ° C dans un bain d'eau. Pré-manteau six pipettes en plastique (10 ml) avec HS et sec pendant au moins 10 min avant utilisation. Dans la hotte de culture, transférer chaque muscle dans un puits d'une plaque à 6 puits. En utilisant les ciseaux de dissection, couper le muscle en petits morceaux d'environ 2 mm. Veillez à ne pas hacher le tissu trop. Ajouter avec précaution 2,5 ml d'une solution de pronase à 0,1% à chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 60 min. Secouer doucement la plaque après 20, 40, et 60 min. Remarque: Le duratio exacten de l'incubation dépend de facteurs tels que l'âge et la souche des animaux. Surveiller sous le microscope. Vérifiez les fragments de muscle et d'arrêter la digestion enzymatique lorsque les faisceaux de fibres obtiennent une apparence desserré (figure 5). Ajouter 2,5 ml de DMEM supplémenté avec 10% de HS et 1% P / S. Transférer dans un tube de 15 ml et on centrifuge les tubes à 400 xg pendant 5 min. Jeter le surnageant par décantation. Ajouter 5 ml de DMEM supplémenté avec 10% de HS et 1% P / S. Pipeter la solution de haut en bas avec une pipette de 10 ml en matière plastique (trituration) pendant au moins 20 heures pour homogénéiser le tissu. Centrifuger les tubes à 200 xg pendant 4 min. Récupérer le surnageant et le transférer dans un tube de 15 ml. Ajouter 5 ml de DMEM supplémenté avec 10% de HS et 1% P / S. Pipette à nouveau avec une pipette en matière plastique de 10 ml jusqu'à ce que les fragments de tissus traverse facilement la pipette. Centrifuger les tubes à 200 x g pendant 4 minutes et recueillir le surnageant dans un tube de 15 ml. Put un tamis cellulaire (40 um) sur un tube de 50 ml et transférer le surnageant contenant les cellules dissociées sur le filtre. Laver avec 1 ml de DMEM pour la récupération maximale des cellules. Centrifuger les tubes à 1000 g pendant 10 min et jeter le surnageant avec une pipette. Reprendre le culot dans 300 pi de milieu de culture et de compter les cellules dans un hémocytomètre. 4. différenciation des cellules satellites sur Spots Gel matrice extracellulaire Diluer la suspension cellulaire pour obtenir 1,5 x 10 3 cellules dans 10 ul de milieu de culture. Fixez les couvercles des chambres diapositives avec du ruban adhésif et marquer les points avec un marqueur noir sur la face inférieure de la vitre de l'objet. Avec une micropipette, mettre une goutte de 10 pi de suspension cellulaire sur le point de gel de la matrice extracellulaire. Vérifiez sous le microscope de savoir si la baisse de la suspension cellulaire a été placé correctement sur place. Incuber pendant six heures à 37 ° C. Prudently ajouter 400 pi de milieu de culture (DMEM supplémenté avec 20% de FBS, 10% HS, 1% P / S et 1% CEE) et incuber pendant trois jours à 37 ° C. Remarque: À ce stade, SC fraîchement isolés sont soumis à un traumatisme massif (digestion enzymatique et la trituration dure) et ils ont besoin de récupérer. Ne pas déranger les cellules au cours des trois premiers jours 37. Ensuite, le milieu de culture peut être modifié en fonction du type d'expérience. Les taches de gel de la matrice extracellulaire peuvent être ensemencées avec une densité de cellules élevée (1.5 à 2.5 x 10 3/20 ul) pour l'analyse de la différenciation. Le milieu de culture (DMEM supplémenté avec 20% de FBS, 10% de HS, 1% P / S et 1% d'extrait d'embryon de poulet) peut être remplacé tous les trois jours. Sinon, si l'expansion et le passage est souhaité suivre les étapes suivantes: Décongeler un gel de matrice extracellulaire aliquote (500 ul) à 4 ° C pendant au moins 1,5 h. Diluer à 1:10 dans DMEM et suivez les recommandations au point 1.1.1. Pré-refroidir d'une pipette de 10 ml pendant 10 min à 4 et# 176; C. Transfert trois flacons T75 sur une surface froide (par exemple une poche de congélation) pendant 10 min. Utilisez la pipette pré-réfrigérés à mettre 1 ml de gel de la matrice extracellulaire dans chaque flacon. Vérifier que la surface est complètement recouverte. Gardez les flacons sur la surface froide pendant au moins une autre 7 min (figure 1A). Complètement enlever le gel de la matrice extracellulaire restant avec un pipette de 10 ml, et sécher les puits à 37 ° C pendant 1 heure. Après le dépouillement, remettre en suspension les Centres fraîchement isolées dans 10 ml de milieu de culture (DMEM supplémenté avec 20% de FBS, 10% de HS, 1% P / S et 1% d'extrait d'embryon de poulet) et des semences dans des fioles pré-revêtu T75. Après trois jours, de changer le milieu (et tous les trois jours) jusqu'à 80% de confluence est atteinte. Pour les passages, laver les flacons T75 à trois reprises avec du PBS. Ensuite, ajoutez 1 ml 0,25% solution de trypsine et incuber pendant trois minutes à 37 ° C. Remettre en suspension dans 9 ml de milieu de culture (DMEM supplémenté avec 20% de FBS, 10% de HS, 1% P / Set 1% d'extrait d'embryon de poulet) et centrifuger à 200 g pendant 5 min. Jeter le surnageant. Après le dépouillement, remettre en suspension 1 x 10 6 cellules dans 1000 ul de milieu de culture et de geler les cellules.

Representative Results

En utilisant ce protocole, le muscle masséter (d'un côté) donne 0,8-1 x 10 6 cellules, le muscle digastrique (ventre postérieur) donne 1,5-2 x 10 5 cellules, et releveur veli rendements palatini musculaires 1-1,5 x 10 5 cellules. les rendements cellulaires dépendent du type de muscle, la souche, et l'âge de l'animal. A titre de comparaison entre les trois groupes de muscles, Centres fraîchement isolées ont été ensemencées à la même densité de cellules (1,5 x 10 3/10 pi). Directement après isolement, plus de 90% des cellules expriment Pax7 fraîchement isolées (figure 6). Le jour 4, 7 et 10 cultures ont été colorées avec des anticorps contre Pax7, MyoD, MyoG MyHC et immunocoloration. Cinq champs arbitraires ont été comptés par la culture en utilisant un objectif 20X. Au jour 4 Pax 7 et Myo D est exprimée dans tous les groupes musculaires (figures 6 et 7 et 8), cependant la descendance de SatCs du masséter et les muscles commencent digastriques expreschanter myogénine plus tôt que le muscle élévateur du voile du palais musculaire (Figure 9). Au jour 10, l'expression de MyoG est fortement réduite dans tous les groupes (Figure 9). Quelques jours après le semis sur les extracellulaires taches de gel de la matrice, les cellules proliférantes commencent à fusionner et former des myotubes multi-nucléées, qui expriment la chaîne lourde de la myosine. Les petites myotubes sont clairement visibles à 7 jours (Figure 10). Au jour 10, des contractions des myotubes peut être observée (vidéo 1). Figure 1:. Taches de gel de matrice extracellulaire dans un coulisseau de chambre (A) pour une manipulation facile, placer le coulisseau de chambre 8 puits dans une boîte de Petri de 100 mm. Pipet 10 pi gel de la matrice extracellulaire dans chaque chambre et le mettre sur une surface froide (7 min). (B) Chambre diapositive après l'excédent de la matrice extracellulaire gel est enlevé. Figure 2:. Dissection du muscle masséter (A) Chef de l'animal dans une vue latérale. Ear (E), de la glande parotide (P) et le nerf facial (VII). (B) tendineuse aponévrose (Te) de la tête superficielle du muscle masséter (Ms) et muscle temporal (T). Séparer le tendon de son insertion avec une pince. (C) disséquer soigneusement le muscle jusqu'à son insertion au ramus de la mandibule. E: oreille, P: glande parotide, VII: nerf facial, T: muscle temporal, Mme: tête superficielle du muscle masséter, Te: tendon, Mp: profonde tête du muscle masséter. Figure 3: Dissection du ventre postérieur du digastrique (.A) Chef de l'animal en position couchée. Localisez la glande sous-maxillaire (Sg), masséter (M), nerf facial (VII) et le muscle sterno (SCM). Retirez la glande sous-maxillaire. (B) Localisez la partie antérieure du muscle digastrique (AD) et le ventre postérieur (PD). Avec une pince droite, prendre le tendon antérieur du ventre postérieur, couper et disséquer avec soin jusqu'à son origine dans la bulle tympanique (ty). E: oreille, Sg: glande sous-maxillaire, VII: nerf facial, M: masséter, SMC: muscle sterno, AD: antérieure ventre digastrique, PD: postérieure ventre digastrique, Ty: bulle tympanique. Figure 4:. Dissection du muscle releveur de Veli palatini (A) Vue générale après dissection du muscle digastrique (ventre postérieur). Muscle stylohyoïdien (St) et tendon du muscle releveurvoile du palais peut être localisée. Notez la trachée (T) et de l'œsophage (Es) passant derrière elle. (B) Après avoir soulevé la trachée et l'oesophage du pharynx (P) est exposé. L'insertion de la palatini releveur du voile dans le voile du palais est maintenant visible. La flèche indique le palais mou disséqué avec les Palatini muscles élévateurs de Veli sur les deux côtés. E: oreille, St: muscle stylohyoïdien, VII: nerf facial, M: masséter, AD: antérieure ventre digastrique, PD: postérieure ventre digastrique, T: trachée, Es: oesophage, P: pharynx, * muscle élévateur du voile du palais musculaire . Figure 5: Aspect du tissu musculaire (A) et avant (B) après digestion enzymatique avec de la pronase. Notez que les faisceaux musculaires semblent être desserrée après la digestion enzymatique. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "always"> Figure 6: Pax 7 immunocoloration Centres fraîchement isolées, appliqués à un gel de matrice extracellulaire, à la fin de l'isolement (environ 6 heures après digestion de tissu initial).. Cinq domaines arbitraires ont été comptées en utilisant un objectif 10X avec une moyenne de 210 cellules par champ. Environ 90% des cellules sont Pax 7 positive. DAPI: bleu, Pax7: rouge. La barre d'échelle, 100 um. Figure 7:. Pax 7, MyoD immunocoloration jour 4, 7 et 10 cultures ont été colorées avec des anticorps contre Pax7, MyoD et immunocoloration. (A – C) et (D – F) photomicrographies représentatives de la journée 4 et 7 cultures du muscle masséter. (G et H </strong>) Le nombre de Pax7 et MyoD + + noyaux par champ microscopique a été comptée et exprimée en pourcentage du nombre total de noyaux (DAPI). DAPI: bleu, Pax7: rouge, et MyoD: vert. bar des balances 100 um. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 8:. Répartition des Pax7 ± / MyoD ± dans des cultures de cellules mononucléées dans les cultures du masséter, digastrique et releveur veli muscle palatine (A – C) Jour 4, 7 et 10 cultures ont été colorées avec des anticorps contre Pax7, et MyoD immunocoloration. Le nombre total de cellules est basé sur le nombre total de noyaux (DAPI). (D) de quantification de données de Pax7 ± / ± MyoD cells. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 9:. Immunocoloration Myogenin jour 4, 7 et 10 cultures ont été colorées avec des anticorps contre Myogenin. (A – D) photomicrographies représentatives de la journée 4 et 7 cultures du releveur du voile palatin musculaire. (E) Le nombre de noyaux MyoG + par champ microscopique a été comptée et exprimée en pourcentage du nombre total de noyaux (DAPI). Quantification (F) de données de cellules MyoG +. DAPI: bleu, Myogenin: vert. bar des balances 100 um. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 10:. Myosine chaîne lourde immunocoloration Jour 4, 7 et 10 cultures ont été colorées avec des anticorps contre la myosine chaîne lourde (MyHC). Photomicrographies représentatives de la journée 4, 7 et 10 cultures du digastrique (DIG) musculaire. Au jour 7, petites myotubes sont présents tout au jour 10 myotubes longues et bien organisés sont évidents. bar des balances 200 um. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. Vidéo 1:.. Myotubes secousses exemples de deux champs représentatifs avec myotubes secousses sont présentés pour la journée 10 cultures de muscle digastrique S'il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo.

Discussion

Centres de différents muscles de la tête branchiomeric ont été isolés à partir d'un 9-semaine-vieux rat Wistar et cultivées directement sur la matrice extracellulaire des taches de gel sans expansion préalable et passages. Après isolement, les cellules ont été comptées et ensemencées à la même densité de cellules. Pour l'isolement parallèle de trois muscles différents, cette méthode prend environ 4 heures. Pour éviter la contamination de la culture, une étape cruciale est le lavage rapide de l'alcool à 70% après la dissection des muscles.

Pendant SC isolement il est important de couper le tissu musculaire en petits morceaux (environ 2 mm), mais éviter trop de hachage que cela se traduira par un petit rendement cellulaire à cause de dommages cellulaires. En outre, la durée de la digestion enzymatique doit être contrôlée avec soin sous un microscope afin d'éviter d'autres dommages. Le but de la digestion est de dissocier les myofibres. Etant donné que plus de 90% des cellules expriment Pax7 isolées, aucune purification supplémentaire est requise (figures 6-8).Cela évite des étapes de purification supplémentaires dans d'autres méthodes telles que le pré-placage sur plats non couchés 14,37,38, fractionnement sur ​​Percoll 39,40, une cellule ou fluorescent- ou tri magnétique 41,43. Par trituration il est essentiel d'induire un cisaillement entre les fragments de tissus et l'ouverture de l'embout de pipette car cela permet la libération mécanique du SC. Si la trituration avec une pipette de 10 ml (intérieur du bout de diamètre: 1 mm) est difficile, 5 ml (intérieur pointe de diamètre: 2 mm) pipette peuvent être utilisés en premier. Alternativement, verre pipettes Pasteur peuvent être coupées au niveau du diamètre désiré et être utilisés. Cette méthode est simple, efficace et permet l'isolement simultané de SC à partir de différents échantillons de muscles.

Les plaques de culture pour les Centres peuvent également être enrobés avec de la gélatine ou du collagène, mais nos études précédentes montrent que le gel de la matrice extracellulaire est de loin préférable pour le maintien du potentiel myogénique de 38 collagène. Les taches de gel de matrice extracellulaires detaille millimétrique (10 pl / Ø 2 mm ou 20 pl / Ø 4 mm) permet l'étude de la prolifération et la différenciation des CS avec un nombre limité de cellules. Pour le test de différenciation environ 8 à 20 fois moins de cellules sont nécessaires par rapport à une plaque de 24 puits (Ø 15,6 mm), et environ 80 à 200 fois moins par rapport à 35 mm boîtes de Petri (Ø 35 mm) 14,38.

Étant donné que le gel de la matrice extracellulaire est coûteux, ce procédé est aussi plus rentable. En outre, les diapositives de la chambre peuvent être remplacés par couvercle en plastique glisse de réduire davantage les coûts. Pour la préparation du gel de la matrice extracellulaire voit séchage pendant une nuit des lames creuses est essentielle. Comme les taches extracellulaires de gel de la matrice sont transparents, il est nécessaire de marquer les taches sur le côté bas en utilisant un rétro-éclairage. Les diapositives de chambres sont fixées dans une boîte de Pétri pour la manipulation facile. L'expansion de la culture cellulaire ne sont pas nécessaires, ce qui offre la possibilité d'étudier la Centres de smaller muscles ou de petits échantillons de muscle. Alternativement, par exemple pour la PCR ou le muscle construit si plusieurs cellules sont nécessaires, les Centres fraîchement isolés peuvent d'abord être développées dans des ballons T75 comme indiqué ci-dessus.

SC isolé en utilisant ce protocole ne sont pas adaptés pour une purification supplémentaire avec la cytométrie de flux immédiatement après l'isolement. La digestion à la pronase provoque une digestion poussée de la surface des antigènes 14. sérum de cheval et le sérum de veau fœtal qui sont utilisés pour la culture cellulaire doivent d'abord être correctement caractérisés avant l'isolement, comme des numéros de lots touchés différemment prolifération et la différenciation des myoblastes.

Au cours des dernières années, il ya un intérêt croissant dans les muscles dérivés des arcs branchiaux et le mésoderme de la tête (par exemple les muscles extra-oculaires) 24. Il a été clairement démontré que la tête et des membres muscles possèdent des propriétés très différentes. Masséter de vieux animaux semble à nouveautain de leur capacité de régénération en comparaison avec les muscles des membres 25,26. Centres des muscles extra-oculaires possèdent une capacité de prolifération et la différenciation robuste comparable à SC de muscles de la tête, et de montrer un potentiel de prise de greffe musculaire plus importante que membre SC 24.

La composition de la distribution des types de fibres et de la myosine varie selon les groupes de muscles et également entre les espèces. Muscles provenant du premier arc branchial chez les humains contiennent des fibres à la fois lents et rapides (sous-types IIA et IIX), les myosines néonatales et myosines typiques pour développer le muscle cardiaque. Chez les rongeurs ces muscles contiennent environ 95% IIA fibres rapides de la myosine et IIb) 44-46. Les études sur les muscles aviaire montrent que les conseils sectoriels de types de fibres musculaires différents varient en capacité de différenciation. Centres de fibres rapides ne se différencient en fibres musculaires rapides, tandis que SC de fibres lentes peuvent se différencier en deux types de fibres 47. En outre, le pourcentage de SC dans le muscle rapidedes fibres est plus faible que dans les fibres musculaires lentes 48,49. Cela indique que la distribution des types de fibre doit être prise en compte pour les études sur les muscles dans la région craniofaciale. Similaires aux muscles de fente palatine, la LVP chez les rongeurs contient presque exclusivement fibres rapides 50. Pour cette raison, Centres de la LVP sont adaptés pour les études pré-cliniques dans le domaine de la fente palatine.

Ce protocole offre de nouvelles possibilités pour étudier SC issus de muscles de la tête branchiomeric ou d'autres petits muscles ou des échantillons de muscles plus petits. Cela facilitera le développement de nouvelles thérapies pour améliorer la régénération des muscles de la région maxillo-faciale dans des conditions comme la fente palatine, mais aussi dans d'autres conditions qui affectent les petits muscles.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This study was funded by a Mosaic grant (017.009.009) from The Netherlands Organization for Scientific Research (NWO) and a Start grant (S-13-167C) for young investigators from the AO Foundation. Z.Y.R is supported by the National Institutes of Health (grant # AG021566, AG035377, NS090051).

Materials

Hypodermic Needle 25G 0,5x25m BD Microlance 300400
Dissecting scissors Braun BC154R
Micro forceps straight Braun BD330R
Surgical Scalpel Blade No.15 Swann-Morton 0205
Alcohol 70% Denteck 2,010,005
Permanox Slide, 8 Chamber Thermo Scientific 177445
6 well cell culture plate Greiner bio-one 657160
Cell Culture Dishes (100 x 20 mm) Greiner bio-one 664160
15 ml sterile conical centrifuge tube BD Biosciences 352097
50 ml sterile conical centrifuge tube BD Biosciences 352098
Cell strainer (40 μm) Gibco 431750
10 mL serological pipette Greiner bio-one 607180
20µL FT20 Greiner bio-one 774288
Matrigel, Phenol-Red Free BD Biosciences 356237 10 mL
Pronase Calbiochem 53702 10KU
Phosphate Buffered Saline Gibco 14190-144 500 mL
Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate  Gibco 10569-010 500 mL
Fetal Bovine Serum   Fisher Scientific  3600511 500 mL
Horse Serum Gibco 26050088 500 mL
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140-122 100 mL
Chicken Embryo Extract MP Biomedicals 2850145 20 mL
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References

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Carvajal Monroy, P. L., Yablonka-Reuveni, Z., Grefte, S., Kuijpers-Jagtman, A. M., Wagener, F. A., Von den Hoff, J. W. Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles. J. Vis. Exp. (101), e52802, doi:10.3791/52802 (2015).
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