Isolatie en karakterisering van Satellite Cellen van Rat Head Branchiomeric Spieren

Alle experimenten hierin beschreven werden door de lokale raad voor Dierproeven van de Radboud Universiteit Nijmegen is goedgekeurd in overeenstemming met de Nederlandse wet- en regelgeving (RU-december 2013-205). 1. Extracellulaire Matrix Gel Locaties Voer de volgende stappen een dag voor de isolatie: Ontdooi een hoeveelheid extracellulaire matrix gel (100 ui) bij 4 ° C gedurende ten minste 1,5 uur. Verdun 1:10 in gemodificeerd Eagle's medium Dulbecco's; met 4500 mg / l glucose, 4 mM L-glutamine en 110 mg / ml natriumpyruvaat (DMEM). Houd de extracellulaire matrix gel bij 4 ° C te allen tijde. Let op: abrupte veranderingen in temperatuur zal resulteren in ongelijkmatige coating en kristalvorming. Houd de verdunde extracellulaire matrix geloplossing op ijs gedurende 15 min. Pre-chill een 20 ul micropipet gedurende 10 min. Zet 8-goed kamer dia's in een 100 mm petrischaal en breng het gerecht op een koude ondergrond (bijvoorbeeld een vriezer pack) gedurende 10 min. Met de pre-gekoelde micropipet een druppel 10 gl extracellulaire matrix gel in elk putje gebracht. Houd de petrischaal op de koude ondergrond nog minstens 7 min (Figuur 1A). Volledig verwijderen van de overblijvende extracellulaire matrix gel (Figuur 1B), en droog de ​​putjes bij 37 ° C overnacht. 2. Dissectie van Head Spieren (kauwspieren, de kauw- en Levator Veli Palatini) Vóór versnijding Bereid 50 ml met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) aangevuld met 2% penicilline-streptomycine (P / S). Keep on ice. Na euthanasie van een jonge volwassene rat (9 weken) met een CO 2 / O 2, onthoofden de kop en verwijder de huid van het hoofd. Breng de kop ijskoude PBS gesupplementeerd met 2% P / S in een 50 ml buis. Kauwspieren (afgeleid van de 1e kiemboog) Plaats het hoofd met de ene kant op een siliconen pad en bevestig met onderhuidse needles (Figuur 2A). Identificeer de parotis en de gezichtszenuw (Figuur 2A). Expose de diepe fascia die de klier. Snijd de fascia en verwijder de klier met dissectie schaar. Identificeer de uitwendige gehoorgang. Trace de gezichtszenuw uit de stylomastoid foramen en het tijdelijke, jukbeen en buccale takken verwijder voorzichtig met een scalpel No. 15. Bevrijd de oppervlakkige hoofd van de kauwspieren door het verwijderen van de fascia. Identificeer zowel oppervlakkige en diepe hoofden van de kauwspieren. Trace de oppervlakkige hoofd tot zijn dikke tendineuze aponeurose ingebracht in het jukbeen proces van de bovenkaak. Scheid de pees van zijn oorsprong in het jukbeen proces met een rechte tang. Snijd het met een scalpel No. 15 of dissectie schaar en zorgvuldig leven is (Figuur 2B). Ontleden de oppervlakkige hoofd van de kauwspieren tot zijn inbrengen in de hoek en inferieure helft van tHij mantelvlak van de ramus van de onderkaak met een scalpel No. 15 (figuur 2C). Nu, volledig verwijderen van de spier. Achterste buik van de kauw- spieren (afgeleid van de 2 e kiemboog) Plaats het hoofd in een liggende positie op de siliconen pad en bevestig met injectienaalden (figuur 3A). Verwijder het onderhuidse vet bovenliggende zowel sublinguale en submandibulaire klieren. Verwijder vervolgens de oppervlakkige fascia en klieren met dissectie schaar. Expose de tweebuikvliezend spier (voorste en achterste buik). Houd de voorste pees van het achterste buik met een rechte tang, snijden en ontleden voorzichtig om tot zijn oorsprong in het trommelvlies bulla (Figuur 3B). Doe hetzelfde aan de contralaterale zijde. Levator veli palatini spier (afgeleid van het 4e kiemboog) Na dissectie van de achterste buik van de kauw- spieren, Lokaliseren de musculus stylohyoideus, trek het zijdelings, en verwijder deze (Figuur 4A) voorzichtig. Lokaliseren van de pees van de levator veli palatini dat voegt aan het trommelvlies bulla (Figuur 4A). Ontleden het zorgvuldig en snijd het aan beide kanten. Kijk voor de luchtpijp en de slokdarm dat er achter het loopt. Til de slokdarm en de keelholte, strottenhoofd en het zachte gehemelte bloot. Lokaliseren op het gebied van het zachte gehemelte waar de levator veli palatini is geplaatst en snijd het los (figuur 4B). Opmerking: Direct na dissectie, verwijder voorzichtig pezen en bindweefsel van elke spier onder de stereo-microscoop. Dompel alle exemplaren snel in ethanol 70%, en overbrengen naar ijskoude PBS aangevuld met 2% P / S in een 15 ml buis. 3. Isolatie van satelliet-cellen Voer de volgende voorbereidende stappen voor SC isolatie van 3 groepen van de spieren: Bereid 7,5 ml van 0,1% pronase in DMEM. Filtreer de oplossing door een 0,22 pm filter. Vooraf verwarmen van de oplossing bij 37 ° C in een waterbad gedurende 10 min voor isolatie. Bereid 35 ml DMEM aangevuld met 10% paardenserum (HS) en 1% P / S. Ook voorverwarmen bij 37 ° C in een waterbad. Bereid 15 ml kweekmedium bestaande uit DMEM gesupplementeerd met 20% foetaal runderserum (FBS), 10% HS, 1% P / S en 1% kippenembryo extract (CEE). Voorverwarmen bij 37 ° C in een waterbad. Pre-coat zes plastic pipetten (10 ml) met HS en drogen ten minste 10 minuten voor gebruik. In de cultuur kap, breng elke spier in een putje van een 6-wells plaat. De dissectie schaar knippen de spier in kleine stukjes van ongeveer 2 mm. Wees voorzichtig het weefsel niet blad voor de mond te veel. Voeg voorzichtig 2,5 ml 0,1% pronase oplossing in elk putje en incuberen bij 37 ° C gedurende 60 min. Schud de plaat na 20, 40, en 60 min. Opmerking: De exacte DUURn van de incubatie afhankelijk van factoren zoals leeftijd en stam van de dieren. Monitor onder de microscoop. Controleer de spier fragmenten en stoppen van de enzymatische digestie als de vezels bundels ontvang losgemaakte uiterlijk (figuur 5). Voeg 2,5 ml DMEM aangevuld met 10% HS en 1% P / S. Transfer naar een 15 ml buis en centrifugeer de buizen bij 400 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant door decanteren. Voeg 5 ml DMEM gesupplementeerd met 10% HS en 1% P / S. Pipetteer de oplossing op en neer met een 10 ml plastic pipet (fijnwrijven) minstens 20 keer om het weefsel te homogeniseren. Centrifugeer de buizen bij 200 xg gedurende 4 min. Verzamel de bovenstaande vloeistof en breng in een 15 ml buis. Voeg 5 ml DMEM gesupplementeerd met 10% HS en 1% P / S. Wederom pipet met een 10 ml plastic pipet totdat de weefselfragmenten passeert gemakkelijk door de pipet. Centrifugeer de buizen bij 200 xg gedurende 4 minuten en verzamel de bovenstaande vloeistof in een 15 ml buis. Put een cel zeef (40 um) naar een 50 ml buis en breng het supernatant dat de gedissocieerde cellen op het filter. Wassen met 1 ml DMEM voor maximale celherstel. Centrifugeer de buisjes bij 1000 xg gedurende 10 min en het supernatant met een pipet ontdoen. Resuspendeer de pellet in 300 pl cultuurmedium en tel de cellen in een hemocytometer. 4. Differentiatie van satelliet-cellen op de extracellulaire matrix Gel Spots Verdun de celsuspensie tot 1,5 x 10 3 cellen te verkrijgen in 10 pl kweekmedium. Bevestig de covers van de kamers dia's met tape en markeer de plekken met een zwarte marker op de onderkant van het object glas. Met behulp van een micropipet, een druppel van 10 ui celsuspensie op de extracellulaire matrix gel spot. Controleer onder de microscoop of de druppel celsuspensie correct is geplaatst op de plek. Incubeer gedurende zes uur bij 37 ° C. Voorzichtigly voeg 400 ul kweekmedium (DMEM gesupplementeerd met 20% FBS, 10% HS, 1% P / S en 1% CEE) en incubeer gedurende drie dagen bij 37 ° C. NB: Op dit punt, zijn vers geïsoleerde SC onderworpen aan massale trauma (enzymatische digest en hard wrijven) en die ze nodig hebben om te herstellen. Laat de cellen niet verstoren tijdens de eerste drie dagen 37. Vervolgens kan het kweekmedium worden veranderd afhankelijk van het soort experiment. De extracellulaire matrix gel spots zijn geënt met een hoge celdichtheid (1,5-2,5 x 10 20/03 ul) tot differentiatie assay. Het kweekmedium (DMEM gesupplementeerd met 20% FBS, 10% HS, 1% P / S en 1% extract van kippenembryo's) kunnen elke derde dag vervangen. Als alternatief, als uitbreiding en passing gewenst is volg dan de volgende stappen: Ontdooi een hoeveelheid extracellulaire matrix gel (500 ui) bij 4 ° C gedurende ten minste 1,5 uur. Verdun 1:10 in DMEM en volg de aanbevelingen in punt 1.1.1. Pre-chill een pipet 10 ml gedurende 10 min bij 4 &# 176; C. Transfer drie T75 flessen op een koude ondergrond (bijvoorbeeld een vriezer pack) gedurende 10 min. Met de pre-gekoelde pipet 1 ml extracellulaire matrix gel gebracht in elke kolf. Controleer dat het oppervlak volledig bedekt is. Houd de kolven op het koude oppervlak nog tenminste 7 min (Figuur 1A). Volledig verwijderen van de overblijvende extracellulaire matrix gel met een pipet 10 ml, en droog de putjes bij 37 ° C gedurende 1 uur. Na het tellen, resuspendeer de vers geïsoleerde SC in 10 ml kweekmedium (DMEM gesupplementeerd met 20% FBS, 10% HS, 1% P / S en 1% kippenembryo extract) en zaad in de pre-coated T75 flessen. Na drie dagen, wijzigt het medium (en elke derde dag) tot 80% confluentie bereikt. Voor passage, was de T75 kolven driemaal met PBS. Voeg vervolgens 1 ml 0,25% trypsine-oplossing en incubeer gedurende drie minuten bij 37 ° C. Resuspendeer in 9 ml kweekmedium (DMEM gesupplementeerd met 20% FBS, 10% HS, 1% P / Sen 1% kippenembryo extract) en centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant. Na het tellen, mengen 1 x 10 6 cellen in 1000 ul kweekmedium en het bevriezen van de cellen.