Una técnica de enriquecimiento optimizado para el aislamiento de<em> Arthrobacter</em> Bacteriófago Especies de Aísla Muestra de Suelo
Summary
We present an enrichment protocol for the isolation of bacteriophages infecting bacteria in the Arthrobacter genus. This enrichment protocol produces fast and reproducible results for the isolation and amplification of Arthrobacter phages from soil isolates.
Abstract
Bacteriophage isolation from environmental samples has been performed for decades using principles set forth by pioneers in microbiology. The isolation of phages infecting Arthrobacter hosts has been limited, perhaps due to the low success rate of many previous isolation techniques, resulting in an underrepresented group of Arthrobacter phages available for study. The enrichment technique described here, unlike many others, uses a filtered extract free of contaminating bacteria as the base for indicator bacteria growth, Arthrobactersp. KY3901, specifically. By first removing soil bacteria the target phages are not hindered by competition with native soil bacteria present in initial soil samples. This enrichment method has resulted in dozens of unique phages from several different soil types and even produced different types of phages from the same enriched soil sample isolate. The use of this procedure can be expanded to most nutrient rich aerobic media for the isolation of phages in a vast diversity of interesting host bacteria.
Introduction
La ubicuidad de las especies Arthrobacter en entornos de suelo ofrece un gran número y diversidad de fagos capaces de ser aislado a partir de esta especie de bacteria huésped. Miembros bacterianas de la familia Acintobacteriaceae son más notables por sus vías catabólicas de degradar compuestos recalcitrantes como la atrazina y varios otros pesticidas y herbicidas 1,2,3. Aunque la mayoría de investigaciones se ha hecho uso de cepas ambientales de Arthrobacter, aislados clínicos de este género se encuentran en la sangre, la orina, los ojos y muchas otras fuentes humanas que muestran toda la heterogeneidad filogenético 4.
Si bien no es un lugar amplio cuerpo de investigación sobre bacterias Arthrobacter, sólo unos pocos estudios informan sobre los fagos capaces de infectar a los miembros de este diverso género. Curiosamente, sin embargo, el trabajo realizado previamente en Arthrobacter fagos toques sobre varios temas clave diferenciadas, como la tipificación de suelo <em> especies Arthrobacter 5, usos industriales con el fin de reducir la espuma perjudicial en las plantas de tratamiento de lodos activados 6, y el trabajo destacando recombinación específica de sitio y los genes de la integrasa 7.
Varios protocolos técnica de enriquecimiento se han empleado para generar pura fago aísla en especies de Arthrobacter. Los primeros procedimientos incluyen incubaciones de suelo con agentes tóxicos adicionales como sales de nicotina durante períodos de más de un año 8 dando lugar a los fagos capaces de infectar sólo A. globiformis. Los estudios realizados utilizando suelo percola con productos orgánicos lábiles parecían producir fagos detectables a través de técnicas de ensayo de placa, omitiendo largos períodos de incubación 8. Curiosamente, sin embargo, se utilizó una técnica parecida a la siembra directa en el pasado dando lugar a varios fagos mientras que todavía tiene una baja tasa de éxito particular por los investigadores 5, citando estudios anteriores con bajas tasas de éxito <sarriba> 8.
En general, las técnicas de aislamiento utilizados en el pasado eran destaca por tener poca eficacia en la práctica a pesar de género Arthrobacter que representan el suelo aeróbico más común aislar en la naturaleza 4,9,, Van Twest y Kropinski 10 presentes métodos de enriquecimiento para el aislamiento de fagos a partir de agua y el suelo adaptado de técnicas anteriores utilizadas para enriquecer aislamientos bacterianos ambientales, pero estas técnicas de enriquecimiento resultó ineficaz en el aislamiento de los fagos Arthrobacter. El propósito del método descrito aquí es mostrar "prueba de concepto" que los métodos de enriquecimiento primeros pueden ser adaptados para aislar de manera consistente y eficaz fagos Arthrobacter, la superación de dificultades técnicas anteriores asociadas con el aislamiento de fagos de este género bacteriano.
Protocol
Representative Results
Discussion
A pesar de muchos intentos anteriores para aislar fagos capaces de infectar ordenadores Arthrobacter, tuvimos poco éxito utilizando procedimientos de enriquecimiento estándar. El método generalizado de enriquecimiento bacteriana desarrollado y adaptado por van Twest y Kropinski 10 para enriquecer fagos a partir de muestras ambientales sigue siendo la base para la mayoría de procedimientos de enriquecimiento. La evidencia de estudios previos sugieren que los métodos de siembra directa han produci…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los fondos para el desarrollo de este protocolo fue proporcionada por el Consorcio Sureste de Pensilvania para la Educación Superior y el Departamento de Ciencias Cabrini Colegio. Financiamiento y apoyo adicional vino de Arcadia University y la Universidad Immaculata. Agradecemos especialmente a la doctora Karen Snetselaar en la Universidad de San José para tomar amablemente las imágenes de microscopía electrónica de nuestros fagos aislados. Apoyo adicional fue proporcionado por los cazadores del Instituto Médico Howard Hughes de la Alianza de Educación Científica de fagos que subieron Genómica y programa (SEA-FAGOS) Evolutiva Ciencia.
Materials
| LB Broth powder | Fisher | BP9722-2 | It's best to order these in bulk. |
| Granulated Agar | Fisher | BP1423-2 | It's best to order these in bulk. |
| 0.22 um syringe filters | Fisher | 09-719A | |
| .22 um buchner filters | Fisher | 430320 | More than 50 mL of liquid can be obtained by carefully swapping the receiving tube. |
| Eppendorf Tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 5 mL pipets individual | Fisher | 13-678-11D | |
| 50 mL conical tubes | Fisher | 76002844 | |
| 15 mL conical tubes | Fisher | 76002845 | |
| 10 mL pipets individual | Fisher | 13-676-10J | |
| 25 mL pipets individual | Fisher | 13-676-10K | |
| Whatman qualitative filter paper | Fisher | 1001-824 |
References
- Shapir, N., Mongodin, E. F., Sadowsky, M. J., Daugherty, S. C., Nelson, K. E., Wackett, L. P. Evolution of Catabolic Pathways: Genomic Insights into Microbial s-Triazine Metabolism. J Bacteriol. 189 (3), 674-682 (2007).
- Qingyan, L., Ying, L., Xikun, Z., Baoli, C. Isolation and Characterization of Atrazine Degrading Arthrobacter sp. AD26 and Use of this Strain in Bioremediation of Contaminated Soil. J Environ Sci. 20, 1226-1230 (2008).
- Wang, J., Zhu, L., Liu, A., Ma, T., Wang, Q., Xie, H., Wang, J., Jiang, T., Zhao, T. Isolation and characterization of an Arthrobacter sp. Strain HB-5 that Transforms Atrazine. Environ Geochem Hlth. 33, 259-266 (2011).
- Mages, I. S., Frodl, R., Bernard, K. A., Funke, G. Identities of Arthrobacter spp. And Arthrobacter-Like Bacteria Encountered in Human Clinical Specimens. J Clin Microbiol. 46 (9), 2980-2986 (2008).
- Brown, D. R., Holt, J. G., Pattee, P. A. Isolation and Characterization of Arthrobacter Bacteriophages and Their Application to Phage Typing of Soil Arthrobacters. Appl Environ Microbiol. 35 (1), 185-191 (1978).
- Petrovski, S., Seviour, R. J., Tillett, D. Prevention of Gordonia and Nocardia Stabilized Foam Formation by Using Bacteriophage GTE7. Appl Environ Microbiol. 77 (21), 7864-7867 (2011).
- Le Marrec, C., Moreau, S., Loury, S., Blanco, C., Trautwetter, a. Genetic Characterization of Site-specific Integration Functions of phi AAU2 infecting “Arthrobacter aureus” C70. J Bacteriology. 178 (7), 1996-2004 (1996).
- Casida, L. E., Liu, K. C. Arthrobacter globiformis and Its Bacteriophage in Soil. J Appl Microbiol. 28 (6), 951-959 (1974).
- Einck, K. H., Pattee, P. A., Holt, J. G., Hagedorn, C., Miller, J. A., Berryhill, D. L. Isolation and Characterization of a Bacteriophage of Arthrobacter globiformis. J Virol. 12 (5), 1031-1033 (1973).
- Twest, R., Kropinski, A. M. Bacteriophage Enrichment from Soil and Water. Methods Mol Bio. 501, 15-21 (2009).
- Fullner, K. J., Hatfull, G. F. Mycobacteriophage L5 Infection of Mycobacterium bovis BCG: Implications for Phage Genetics in the Slow-growing Mycobacteria. Mol Microbiol. 26 (4), 755-766 (1997).
- Robb, S. M., Woods, D. R., Robb, F. T. Phage Growth Characteristics on Stationary Phase Achromobacter cells. J Gen Virol. 41 (2), 265-272 (1978).
- Bolger-Munro, M., Cheung, K., Fang, A., Wang, L. T4 Bacteriophage Average Burst Size Varies with Escherichia coli B23 Cell Culture Age. Journal of Experimental Microbiology and Immunology. 17, 115-119 (2013).
