の単離のための最適化された濃縮技術<em>アルスロ</em>バクテリオファージ種土壌サンプルの分離株から
Summary
We present an enrichment protocol for the isolation of bacteriophages infecting bacteria in the Arthrobacter genus. This enrichment protocol produces fast and reproducible results for the isolation and amplification of Arthrobacter phages from soil isolates.
Abstract
Bacteriophage isolation from environmental samples has been performed for decades using principles set forth by pioneers in microbiology. The isolation of phages infecting Arthrobacter hosts has been limited, perhaps due to the low success rate of many previous isolation techniques, resulting in an underrepresented group of Arthrobacter phages available for study. The enrichment technique described here, unlike many others, uses a filtered extract free of contaminating bacteria as the base for indicator bacteria growth, Arthrobactersp. KY3901, specifically. By first removing soil bacteria the target phages are not hindered by competition with native soil bacteria present in initial soil samples. This enrichment method has resulted in dozens of unique phages from several different soil types and even produced different types of phages from the same enriched soil sample isolate. The use of this procedure can be expanded to most nutrient rich aerobic media for the isolation of phages in a vast diversity of interesting host bacteria.
Introduction
土壌環境でのロバクター種の普遍性は、宿主細菌のこの種から単離されることができるファージの膨大な数と多様性を提供しています。 Acintobacteriaceaeファミリーの細菌メンバーは、アトラジン、様々な他の殺虫剤や除草剤の1,2,3のような扱いにくい化合物を分解することが彼らの異化経路のための最も注目すべきである。ほとんどの研究は、 アルスロバクターの環境の株を用いて行われたが、この属の臨床分離株は、血液、尿、目、すべての系統発生異質4を表示する他の多くのヒト供給源において見出される。
アースロバクター菌の研究のかなり大規模なボディがありますが、唯一の少数の研究は、この多様な属のメンバーに感染することができるのファージについて報告する。興味深いことにしかし、 アルスロで以前に行われた作業は、土壌のタイピングなど、いくつかの重要な個別のトピックにタッチをファージを<em>のアルスロバクター種5、活性汚泥処理プラント6、及び作業強調部位特異的組換えおよびインテグラーゼ遺伝子7において有害な泡の低減を目的と工業用途。
様々な濃縮技術プロトコルは、純粋なファージは、 アルスロバクター種において単離生成するために使用されてきた。初期の手順は、1年以上8の期間のためのニコチン塩のような追加された有毒物質しかA.に感染することができるのファージを生じさせるとともに、土壌のインキュベーションを含むスロバクター 。不安定な有機物が長い潜伏期間を8を省略し 、プラークアッセイ技術により検出可能なファージを生成するために登場して土を使用して行われた研究は、パーコレート。興味深いことに、ダイレクトプレーティングに似た手法は、低い成功率の過去の研究を引用して、まだ研究者5によって著しく低い成功率を有しながら、いくつかのファージを生じる過去に使用した<s> 8まで。
全体的に、過去に使用される分離技術は、最も一般的な好気性土壌を表すロバクター属にもかかわらず、実際にはほとんど効 果を持つために注目すべきであったが、自然4,9に隔離する、水や土壌からファージを単離するためのヴァンTwestとKropinski 10現在の濃縮方法環境細菌分離株が、これらの濃縮技術を豊かにするために使用される以前の技術から適応は、 アルスロファージを単離する非効率的な証明した。ここで説明する方法の目的は、初期の濃縮方法は、この細菌属からファージを単離することに関連した以前の技術的な課題を克服し、一貫して効果的にアースロファージを分離するように適合させることができることを「コンセプトの証明」を示すことです。
Protocol
Representative Results
Discussion
アルスロホストに感染することができるファージを単離するための多くの以前の試みにもかかわらず、私たちは、標準的な濃縮手順を使用してほとんど成功していた。環境サンプルからファージを豊かにするバンTwestとKropinski 10によって開発され、適合した細菌の濃縮の一般化された方法は、濃縮手順の大多数のための基礎のまま。以前の研究からの証拠は、ダイレクトプレ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロトコルの開発のための資金は、高等教育のための南東ペンシルベニア州コンソーシアムとカブリーニカレッジ科学部によって提供されました。追加の資金と支援はアルカディア大学とImmaculata大学から来ました。我々は、特に親切に私たちの孤立したファージの電子顕微鏡画像を撮影するために、セントジョセフ大学で博士カレンSnetselaarに感謝。追加のサポートは、ゲノミクスと進化科学（SEA-のファージ）プログラムを推進ハワード·ヒューズ医学研究所の科学教育連盟ファージハンターによって提供された。
Materials
| LB Broth powder | Fisher | BP9722-2 | It's best to order these in bulk. |
| Granulated Agar | Fisher | BP1423-2 | It's best to order these in bulk. |
| 0.22 um syringe filters | Fisher | 09-719A | |
| .22 um buchner filters | Fisher | 430320 | More than 50 mL of liquid can be obtained by carefully swapping the receiving tube. |
| Eppendorf Tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 5 mL pipets individual | Fisher | 13-678-11D | |
| 50 mL conical tubes | Fisher | 76002844 | |
| 15 mL conical tubes | Fisher | 76002845 | |
| 10 mL pipets individual | Fisher | 13-676-10J | |
| 25 mL pipets individual | Fisher | 13-676-10K | |
| Whatman qualitative filter paper | Fisher | 1001-824 |
References
- Shapir, N., Mongodin, E. F., Sadowsky, M. J., Daugherty, S. C., Nelson, K. E., Wackett, L. P. Evolution of Catabolic Pathways: Genomic Insights into Microbial s-Triazine Metabolism. J Bacteriol. 189 (3), 674-682 (2007).
- Qingyan, L., Ying, L., Xikun, Z., Baoli, C. Isolation and Characterization of Atrazine Degrading Arthrobacter sp. AD26 and Use of this Strain in Bioremediation of Contaminated Soil. J Environ Sci. 20, 1226-1230 (2008).
- Wang, J., Zhu, L., Liu, A., Ma, T., Wang, Q., Xie, H., Wang, J., Jiang, T., Zhao, T. Isolation and characterization of an Arthrobacter sp. Strain HB-5 that Transforms Atrazine. Environ Geochem Hlth. 33, 259-266 (2011).
- Mages, I. S., Frodl, R., Bernard, K. A., Funke, G. Identities of Arthrobacter spp. And Arthrobacter-Like Bacteria Encountered in Human Clinical Specimens. J Clin Microbiol. 46 (9), 2980-2986 (2008).
- Brown, D. R., Holt, J. G., Pattee, P. A. Isolation and Characterization of Arthrobacter Bacteriophages and Their Application to Phage Typing of Soil Arthrobacters. Appl Environ Microbiol. 35 (1), 185-191 (1978).
- Petrovski, S., Seviour, R. J., Tillett, D. Prevention of Gordonia and Nocardia Stabilized Foam Formation by Using Bacteriophage GTE7. Appl Environ Microbiol. 77 (21), 7864-7867 (2011).
- Le Marrec, C., Moreau, S., Loury, S., Blanco, C., Trautwetter, a. Genetic Characterization of Site-specific Integration Functions of phi AAU2 infecting “Arthrobacter aureus” C70. J Bacteriology. 178 (7), 1996-2004 (1996).
- Casida, L. E., Liu, K. C. Arthrobacter globiformis and Its Bacteriophage in Soil. J Appl Microbiol. 28 (6), 951-959 (1974).
- Einck, K. H., Pattee, P. A., Holt, J. G., Hagedorn, C., Miller, J. A., Berryhill, D. L. Isolation and Characterization of a Bacteriophage of Arthrobacter globiformis. J Virol. 12 (5), 1031-1033 (1973).
- Twest, R., Kropinski, A. M. Bacteriophage Enrichment from Soil and Water. Methods Mol Bio. 501, 15-21 (2009).
- Fullner, K. J., Hatfull, G. F. Mycobacteriophage L5 Infection of Mycobacterium bovis BCG: Implications for Phage Genetics in the Slow-growing Mycobacteria. Mol Microbiol. 26 (4), 755-766 (1997).
- Robb, S. M., Woods, D. R., Robb, F. T. Phage Growth Characteristics on Stationary Phase Achromobacter cells. J Gen Virol. 41 (2), 265-272 (1978).
- Bolger-Munro, M., Cheung, K., Fang, A., Wang, L. T4 Bacteriophage Average Burst Size Varies with Escherichia coli B23 Cell Culture Age. Journal of Experimental Microbiology and Immunology. 17, 115-119 (2013).
