Een Geoptimaliseerd Verrijking Techniek voor de isolatie van<em> Arthrobacter</em> Bacteriophage Soorten uit Soil Sample Isoleert
Summary
We present an enrichment protocol for the isolation of bacteriophages infecting bacteria in the Arthrobacter genus. This enrichment protocol produces fast and reproducible results for the isolation and amplification of Arthrobacter phages from soil isolates.
Abstract
Bacteriophage isolation from environmental samples has been performed for decades using principles set forth by pioneers in microbiology. The isolation of phages infecting Arthrobacter hosts has been limited, perhaps due to the low success rate of many previous isolation techniques, resulting in an underrepresented group of Arthrobacter phages available for study. The enrichment technique described here, unlike many others, uses a filtered extract free of contaminating bacteria as the base for indicator bacteria growth, Arthrobactersp. KY3901, specifically. By first removing soil bacteria the target phages are not hindered by competition with native soil bacteria present in initial soil samples. This enrichment method has resulted in dozens of unique phages from several different soil types and even produced different types of phages from the same enriched soil sample isolate. The use of this procedure can be expanded to most nutrient rich aerobic media for the isolation of phages in a vast diversity of interesting host bacteria.
Introduction
De alomtegenwoordigheid van Arthrobacter soorten in de bodem omgevingen en biedt een groot aantal en de diversiteit van fagen kunnen worden geïsoleerd van deze soort van gastheer bacteriën. Bacteriële leden van de familie Acintobacteriaceae zijn het meest bekend om hun katabole paden van vernederende recalcitrante verbindingen zoals atrazine en diverse andere pesticiden en herbiciden 1,2,3. Hoewel de meeste onderzoek is gedaan met behulp van het milieu stammen van Arthrobacter, wordt klinische isolaten van deze soort gevonden in bloed, urine, ogen, en vele andere menselijke bronnen die allemaal van fylogenetische heterogeniteit 4.
Hoewel er een vrij uitgebreid lichaam van het onderzoek op Arthrobacter bacteriën, slechts een paar studies rapporteren over de fagen kunnen infecteren leden van deze diverse geslacht. Interessant is echter, werk eerder gedaan op Arthrobacter fagen hand gelegd aan een aantal belangrijke verschillende onderwerpen, zoals de typering van de bodem <em> Arthrobacter species 5, industrieel gebruik met het oog op het verminderen van schadelijke schuim in actief slib zuiveringsinstallaties 6, en werk benadrukken locatiespecifieke recombinatie en integrase genen 7.
Verschillende verrijkingstechniek protocollen zijn gebruikt voor het genereren zuivere faag isolaten Arthrobacter species. Vroege procedures omvatten incubaties van de bodem met toegevoegde giftige stoffen zoals nicotine zouten voor een periode van meer dan één jaar 8 die aanleiding geven tot fagen staat alleen infecteren A. globiformis. Studies gedaan met behulp van de bodem gepercoleerd met labiele organische bleek detecteerbare fagen te produceren via plaque assay technieken, met weglating van lange incubatietijd 8. Interessant is echter, een techniek lijkt rechtstreeks plateren werd in het verleden gebruikt die tot verschillende fagen terwijl nog steeds een opmerkelijk lage slagingspercentage van de onderzoekers 5, citeren eerdere studies met lage succespercentages <sup> 8.
Kortom, de isolatietechnieken die in het verleden waren opmerkelijk voor die weinig werkzaamheid in de praktijk, ondanks het geslacht Arthrobacter die de meest voorkomende aerobe bodem isoleren natuur 4,9, Van Twest en Kropinski 10 verrijking onderhavige werkwijzen voor het isoleren van fagen van water en grond aangepast van eerdere technieken gebruikt om het milieu bacteriële isolaten maar deze verrijking technieken verrijken inefficiënt gebleken in het isoleren van Arthrobacter fagen. Het doel van de hier beschreven werkwijze verlangde "proof of concept" dat de vroege verrijking werkwijzen kunnen worden aangepast om consistent en effectief te isoleren Arthrobacter fagen overwinnen voorafgaande technische uitdagingen van fagen isoleren van deze bacteriële genus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ondanks vele eerdere pogingen om fagen kunnen infecteren Arthrobacter gastheren isoleren, we hadden weinig succes met behulp van standaard verrijking procedures. De algemene werkwijze van bacteriële verrijking ontwikkeld en aangepast door van Twest en Kropinski 10 fagen verrijken van milieumonsters blijft de basis voor de meeste verrijking procedures. Bewijs uit eerdere studies blijkt dat methoden van directe plating detecteerbaar plaques op stammen van Arthrobacter hebben geproduceerd, zij…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financiering voor de ontwikkeling van dit protocol is verstrekt door de Southeastern Pennsylvania Consortium voor het hoger onderwijs en de Cabrini College Science Department. Aanvullende financiering en ondersteuning kwam van Arcadia University en Immaculata University. Wij danken vooral Dr. Karen Snetselaar in het St. Joseph Universiteit voor vriendelijk het nemen van de elektronenmicroscopische beelden van onze geïsoleerde fagen. Aanvullende steun werd verleend door het Howard Hughes Medical Institute Science Education Alliance Fagen Jagers Voortschrijdende Genomics en Evolutionaire Science programma (SEA-fagen).
Materials
| LB Broth powder | Fisher | BP9722-2 | It's best to order these in bulk. |
| Granulated Agar | Fisher | BP1423-2 | It's best to order these in bulk. |
| 0.22 um syringe filters | Fisher | 09-719A | |
| .22 um buchner filters | Fisher | 430320 | More than 50 mL of liquid can be obtained by carefully swapping the receiving tube. |
| Eppendorf Tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 5 mL pipets individual | Fisher | 13-678-11D | |
| 50 mL conical tubes | Fisher | 76002844 | |
| 15 mL conical tubes | Fisher | 76002845 | |
| 10 mL pipets individual | Fisher | 13-676-10J | |
| 25 mL pipets individual | Fisher | 13-676-10K | |
| Whatman qualitative filter paper | Fisher | 1001-824 |
References
- Shapir, N., Mongodin, E. F., Sadowsky, M. J., Daugherty, S. C., Nelson, K. E., Wackett, L. P. Evolution of Catabolic Pathways: Genomic Insights into Microbial s-Triazine Metabolism. J Bacteriol. 189 (3), 674-682 (2007).
- Qingyan, L., Ying, L., Xikun, Z., Baoli, C. Isolation and Characterization of Atrazine Degrading Arthrobacter sp. AD26 and Use of this Strain in Bioremediation of Contaminated Soil. J Environ Sci. 20, 1226-1230 (2008).
- Wang, J., Zhu, L., Liu, A., Ma, T., Wang, Q., Xie, H., Wang, J., Jiang, T., Zhao, T. Isolation and characterization of an Arthrobacter sp. Strain HB-5 that Transforms Atrazine. Environ Geochem Hlth. 33, 259-266 (2011).
- Mages, I. S., Frodl, R., Bernard, K. A., Funke, G. Identities of Arthrobacter spp. And Arthrobacter-Like Bacteria Encountered in Human Clinical Specimens. J Clin Microbiol. 46 (9), 2980-2986 (2008).
- Brown, D. R., Holt, J. G., Pattee, P. A. Isolation and Characterization of Arthrobacter Bacteriophages and Their Application to Phage Typing of Soil Arthrobacters. Appl Environ Microbiol. 35 (1), 185-191 (1978).
- Petrovski, S., Seviour, R. J., Tillett, D. Prevention of Gordonia and Nocardia Stabilized Foam Formation by Using Bacteriophage GTE7. Appl Environ Microbiol. 77 (21), 7864-7867 (2011).
- Le Marrec, C., Moreau, S., Loury, S., Blanco, C., Trautwetter, a. Genetic Characterization of Site-specific Integration Functions of phi AAU2 infecting “Arthrobacter aureus” C70. J Bacteriology. 178 (7), 1996-2004 (1996).
- Casida, L. E., Liu, K. C. Arthrobacter globiformis and Its Bacteriophage in Soil. J Appl Microbiol. 28 (6), 951-959 (1974).
- Einck, K. H., Pattee, P. A., Holt, J. G., Hagedorn, C., Miller, J. A., Berryhill, D. L. Isolation and Characterization of a Bacteriophage of Arthrobacter globiformis. J Virol. 12 (5), 1031-1033 (1973).
- Twest, R., Kropinski, A. M. Bacteriophage Enrichment from Soil and Water. Methods Mol Bio. 501, 15-21 (2009).
- Fullner, K. J., Hatfull, G. F. Mycobacteriophage L5 Infection of Mycobacterium bovis BCG: Implications for Phage Genetics in the Slow-growing Mycobacteria. Mol Microbiol. 26 (4), 755-766 (1997).
- Robb, S. M., Woods, D. R., Robb, F. T. Phage Growth Characteristics on Stationary Phase Achromobacter cells. J Gen Virol. 41 (2), 265-272 (1978).
- Bolger-Munro, M., Cheung, K., Fang, A., Wang, L. T4 Bacteriophage Average Burst Size Varies with Escherichia coli B23 Cell Culture Age. Journal of Experimental Microbiology and Immunology. 17, 115-119 (2013).
