Blutprobenentnahme aus der laterale Schwanzvene der Ratte

Alle Experimente wurden unter Verwendung von ausgewachsenen männlichen Long-Evans-Ratten durchgeführt. Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den US National Institutes of Health (NIH) Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee des Massachusetts Institute of Technology und der Animal Care und Verwenden schreiben Amt zugelassener die USAMRMC. 1. Vorbereitung Heparinise der Katheter und der Spritze, indem das abgeschirmte Nadel in einer 500 ul Röhrchen mit Heparin (1000 USP-Einheiten / ml) und dann Ansaugen und Ausstoßen von Heparin-Lösung durch die Nadel. Bringen Sie einen Schmetterling Katheter an der Spritze. Halten Sie das Schild über der Nadel des Katheters, um die scharfe Spitze vor Beschädigungen zu schützen. Zurückzuziehen ein Volumen von Heparin, der etwas größer als das Volumen des Blutes, das gesammelt werden soll. Trennen Sie die Spritze und füllen Sie es mit Luft. Bringen Sie die Spritze mit dem Katheter und verwenden Sie dieLuft, um überschüssige Heparin-Lösung zu vertreiben; sicherzustellen, nur Spuren in der Rohrleitung, Nadel und Spritze bleiben. Legen Sie die sterile Katheter, mit der Spritze noch angebracht, auf eine sterile Oberfläche. Sichern Sie schnell die Ratte in einem sauberen Tuch um sicherzustellen, dass Vorder- und Hinterpfoten sind in einer komfortablen Position und Atmung ist nicht beschränkt. Sichern Sie den Wrap mit Klettband; sicherzustellen, dass äußeren Genitalien sind nicht eingeschnürt. Einen Assistenten sanft und fest zurückhalten die Ratte (Bauch und Rutenansatz) auf einer festen Arbeitsfläche mit der Schwanz hängen über den Rand des Zählers. 2. Blutentnahme Tauchen Sie das Heck in 42 ° C Wasser für 40-50 Sek Blutgefäße erweitern und trocknen Sie den Schwanz mit einem Papiertuch. Suchen Sie die Schwanzvene entlüftet werden (drehen Sie den ganzen Körper mit dem Schwanz verdrehen den Schwanz zu verhindern). Hinweis: Eine ausreichende Erwärmung des Schwanzes ist entscheidend für die rasche collection einer Blutprobe. Wenn der Gefäß verengt ist, ist die richtige Plazierung des Katheters schwierig, und der Blutfluss in beträchtlichem Ausmaß verringert. Heizkissen kann als Alternative zum Eintauchen in Wasser verwendet werden. Identifizieren Sie die Entnahmestelle. Anmerkung: Die Arterie liegt entlang der Mitte der dorsalen Seite des Schwanzes; verwenden Sie nicht diese für die Probenahme. Ziel entweder die linke und rechte Schwanzvenen, die lateral der Arterie liegen. Pigmentierung der Schwanz, der durch den Stamm variiert und mit dem Alter zunimmt, kann ein Teil des Gefäßsystems zu verdunkeln. Ziel einen Abschnitt der Vene in dem unteren Abschnitt des Schwanzes. Wischen Sie den Zielbereich mit 2% Chlorhexidin antiseptischen Lösung. Erzeugen Unterdruck in der Spritze und dem Katheter durch Herausziehen des Kolbens von Null bis ungefähr 50 & mgr; l. Halten Sie den Schwanz sanft und fest in der Nähe der Spitze, um den Schwanz gerade ganzen Probensammlung zu halten. Stellen Sie sicher, dass der Blutfluss nicht durch eine zu enge Griff verschlossen. Langsam setzen Sie den Katheter in die Vene in einem flachen Winkel von ungefähr 5 cm von der Schwanzspitze. Wenn die Vene eingedrungen ist, wird Blut in den Katheter fließt. Ziehen Sie langsam den Kolben der Spritze zu sammeln Sie die gewünschte Lautstärke mit einer konstanten Rate (~ 20 & mgr; l pro Sekunde). Wenden Sie sich an Tierärzten für Informationen über die maximale Blutvolumen, die gesammelt werden können. Die maximale Blutmenge, die gesammelt werden soll, hängt von dem Gewicht und dem Gesundheitszustand der Ratte. Mehr als 15% der Gesamtblutvolumen in einem Zeitraum von 14 Tagen widerrufen Sie nicht. Hinweis: Das Blut ist viel schwieriger, von Tieren, die akut in den Minuten vor der Proben weil Stresshormone verengen die Gefäße betont wurden zu sammeln. Zum Beispiel bewegt Heimkäfig der Ratte auf ein neues Zimmer, wobei einige Minuten, um das Tier, oder wiederholte Einführen des Katheters in eine Vene wickeln werden wahrscheinlich eine akute Stressreaktion auslösen. Erleichtern blood Fluss durch "Melken" der Vene. Führen einen Finger entlang der Länge der Vene von der Basis zur Spitze des Schwanzes, bleiben jedoch mehr als 2 cm von der Spitze des eingesteckten Nadel oder des Katheters kann abgelöste aus der Vene zu werden. Wenn Blut nicht erfolgreich von der ersten Seite des Katheters Eindringen gesammelt werden, weitere Wieder führen Sie die Nadel bis die Vene. Wenn Blut wurde in der Anfangs Website gesammelt, re-Druck die Nadel durch Trennen und anschließendem Verbinden des Katheters und Spritze vor dem Wiedereinsetzen in die Vene. In der Regel vermeiden, zusätzliche Durchführungen. Wie mehrere Durchdringungen können Schwanzvene Zusammenbruch, in dem die Blutversorgung der Schwanz abgeschnitten und die weiche Schwanzgewebe wird nekrotisiert verursachen, einschläfern die Ratte, wenn es Schwanzvene Zusammenbruch. Wenn eine ausreichende Probenmenge erhoben werden, freigeben Druck in der Spritze durch Trennen und Wiederverbinden des Katheters. Saugen Sie leicht mit dem Spritzenkolben (~ 50 & #181; l), und die Nadel aus der Vene zurücktreten. Hinweis: Wenn die Nadel, ohne vorher die Druckentlastungs in die Spritze gezogen wird Blut von der Nadel tropft. Druck auf die Einstichstelle kurzzeitig gelten die Blutung zu stoppen, und wischen Sie den Bereich mit antiseptischen Lösung. Gibt die Ratte in seinen Heimkäfig. 3. Verarbeitung der Blutprobe Saugen Luft, um sicherzustellen, kein Blut im Katheter Nadel bleibt, und mit einer Schere, um den Katheterschlauch direkt über der Nadel zu schneiden. Vertreibt das Blut in ein steriles 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Hinweis: Wenn das Blut durch die Nadel geschoben wird, kann die Scherkraft roten Blutkörperchen führen zu Bruch, die mit vielen stromabwärts Assays stören können. Entfernen Sie die Nadel, um eine Hämolyse zu vermeiden. Zu sammeln Blutplasma, Nutzung Rohre, die EDTA als Antikoagulans (hier enthalten, verwenden Sie 10 ul 0,1 M EDTA für 200-400 ul Blut; sicherzustellen, die Konzentration von EDTA verwendet wird, nicht stören wit der nachgeschalteten Test) und auf Eis. Spin Blutproben bei 2.100 × g in einer gekühlten Zentrifuge (4 ° C) für 10 Minuten innerhalb von 10 Minuten der Sammlung. Elution des Plasmas, die Vermeidung der roten und weißen Blutzellschichten zu stören. Um Blutserum, Ort Proben (ohne Antikoagulans) bei Raumtemperatur für bis zu 30 min zu sammeln, um die Gerinnung zu ermöglichen. Dreh die Sammelröhrchen in einer Kühlzentrifuge (4ºC) bei 2000 x g. Das Serum kann dann eluiert werden. Verwenden Proben sofort oder bei -80 ° C für bis zu einem Jahr.