Использование Титон системы для изучения молекулярных механизмов регенерации данио рерио

Данио является хорошо создана позвоночных модельный организм для изучения многих аспектов развития, физиологии, болезни, и регенерации. С ростом принятия данио в качестве модели для пост-эмбриональных биологических процессов, экспериментальных инструментов для индуцибельного, тканеспецифической манипуляции экспрессии генов или сигнальных путей становятся все более важными. В частности, исследования в органе и придатков регенерации в взрослых данио пострадали от отсутствия инструментов для вскрытия пространственно-временная требованиям сигнальных путей во время этих регенеративных процессов.

В настоящее время три различные системы были использованы для достижения условное, тканеспецифичную экспрессию генов в регенерации органов взрослых данио: система Cre-LOX, мозаичную экспрессию теплового шока индуцируемых трансгенов использованием транспозонов-опосредованной соматической трансгенеза, и систему TETON ^{1 -3.} Титон относится к варианту тетрациклина-продолжениепроката транскрипции система активации, где выражение активируется в присутствии тетрациклина антибиотик или производным, например доксициклин. Система Cre-LOX, как это до сих пор используется в взрослых рыб, опирается на Тамоксифен контролируемой Cre рекомбиназой (CreERT2), экспрессия которого пространственно ограничено регуляторных элементов ткане-специфических. Cre приводом удаление СТОП кассеты облегчает экспрессию интересующего гена с приводом от промотора, который должен быть активным во всех типах клеток ^1. Транспозонов-опосредованной создание мозаично выраженных соматических трансгенов обеспечивает систему для индуцируемой экспрессии трансгена в отдельных клеточных клонов. Введение эмбрионов данио рерио с транспозона, несущего Tol2 представляющий интерес ген под транскрипционным контролем промотора теплового шока приводит к химерных особей, как правило, несущих трансген только в дискретных клеточных клонов в регенерирующей органа ^2. В то время как обе системы позволяют условного ткани-SPEэкспрессия генов специфичны, система Cre-LOX не является обратимым, и стратегия с использованием транспозонов основе клонального маркировки страдает от его стохастического характера. Таким образом, мы и другие недавно адаптированы трансгенных систем Титон для использования в данио, которые облегчают времени и пространстве, контролируемая экспрессия генов, что в дополнение перестраиваемой и обратимой ^3-5.

Система Титон используется здесь включает в себя трансгенной линии драйвера (TetActivator), в котором доксициклин (DOX) -inducible активатор транскрипции (улучшенный обратный тетрациклина трансактиватор, irtTA, короткие Тета) находится под контролем регуляторных последовательностей генома тканеспецифических. Во-вторых, это требует трансгенной линии ответчика (TetResponder), что таит в себе интерес ген под транскрипционным контролем оператора тетрациклина (TET элемент ответа; TetRE) (1А). Таким образом, использование специфических комбинаций TetActivator и TetResponder линий позволяет условного ткани-SPECIфик манипуляции экспрессии генов.

Мы недавно использовали Титон систему, чтобы зонд для тканеспецифических функций Wnt / бета-катенина сигнализации у взрослых данио регенерации хвостовой плавник ^3. В протоколе, изложенной здесь мы описываем рабочий поток для настройки и использования системы Титон у рыбок данио, в частности, для исследований плавника регенерации. Это включает в себя подробные инструкции о том, как генерировать стабильные трансгенных TetActivator и TetResponder линии и протокол для трансгенной индукции у эмбрионов и взрослых данио. Кроме того, мы опишем методы для проверки экспрессии генов тканеспецифической в ​​ребра регенерата, в том числе протокола для подготовки криосрезов взрослых данио плавников. Кроме того, мы обсудим соображения для конструкции TetActivator трансгена, выбор метода трансгенеза и обнаружения экспрессии TetResponder. Следовательно, общая цель этого протокола, чтобы служить в качестве планаДля наладки функциональную систему TETON в данио достичь экспрессии гена условное тканеспецифичную, который может быть применен к любой интересующей ткани.

Мы создали TetActivator вектор, позволяющий для I-SCEI или Tol2-опосредованной поколения устойчивых TetActivator линий с использованием коротких геномных последовательностей, регулирующих (энхансерные фрагменты; Вайдингер лаборатории базы данных плазмиды нет 1247;. 1В). Эта конструкция содержит кассету, состоящую из TetActivator М2 мутантного варианта обратной Tet-репрессора области слита с вирусом простого герпеса VP16 трансактивации домена производная 3F [irtTAM2 (3F)]. Экспрессия TetActivator (Тета) можно легко контролировать, поскольку она является совместной экспрессии с флуорофором AmCyan из той же открытой рамке считывания; p2a пептид опосредует рибосом пропуск, который должен привести к производству Тета и AmCyan как отдельных белков в соотношении 1: 1 отношение ^5,6. Конструкция также содержит poylinker 5'-TetActivator кассеты для облегчения введения геномных регуляторных последовательностей, представляющих интерес с использованием обычных методов клонирования.

Кроме того, мы создали конструкцию, состоящую из описанной выше кассеты TetActivator плюс выбор кассеты канамицину (Weidinger лабораторной плазмиды базе данных нет 1180;. Рис 1С), который может быть объединяется в бактериальной искусственной хромосомы (ВАС), содержащего большое области геномной ( Обычно в старт-кодоном гена, экспрессия образец должен быть имитируется трансгена). Обе конструкции доступны из лаборатории Weidinger по запросу.