L'utilizzo del sistema di Teton per studiare Meccanismi molecolari della rigenerazione Zebrafish

Il pesce zebra è una ben consolidata organismo modello vertebrato per studiare molti aspetti dello sviluppo, fisiologia, patologia, e la rigenerazione. Con la crescente adozione di zebrafish come modello per i processi biologici post-embrionali, strumenti sperimentali per, la manipolazione inducibile tessuto-specifica dell'espressione genica o vie di segnalazione sono diventati sempre più importanti. In particolare, gli studi in organo e rigenerazione appendice in zebrafish adulti hanno sofferto di una mancanza di strumenti per la dissezione dei requisiti spazio-temporali di vie di segnalazione durante questi processi rigenerativi.

Attualmente, tre diversi sistemi sono stati utilizzati per realizzare condizionale, espressione tessuto-specifica del gene in rigenerazione organi di zebrafish adulto: il sistema Cre-lox, espressione mosaico di heat-shock transgeni inducibile mediante trasposoni mediata transgenesi somatica, e il sistema di Teton ^{1 -3.} TETON riferisce ad una variante di un tetraciclina-CONTlaminati sistema di attivazione trascrizionale, dove l'espressione viene attivato in presenza di tetraciclina o un suo derivato, ad esempio doxiciclina. Il sistema Cre-lox, come è finora stato utilizzato in pesci adulti, si basa su un ricombinasi Tamoxifen controllato Cre (CreERT2), la cui espressione è spazialmente limitata da elementi regolatori tessuto-specifici. Rimozione Cre-driven di una cassetta di STOP facilita l'espressione del gene di interesse guidata da un promotore che deve essere attiva in tutti i tipi cellulari ^1. Creazione Transposon mediata di transgeni somatiche mosaically espresse offre un sistema di espressione del transgene inducibile in linee cellulari individuali. Iniezione di embrioni di zebrafish con trasposone Tol2 che porta un gene di interesse sotto il controllo trascrizionale di un shock termico risultati promotore in individui chimerici tipicamente portano il transgene solo in linee cellulari discreti di un organo rigenerante ^2. Mentre entrambi i sistemi permettono condizionale tessuti speespressione genica fica, il sistema Cre-lox non è reversibile, e la strategia di utilizzo di etichettatura clonale basato trasposoni-risente della sua natura stocastica. Così, noi ed altri hanno recentemente adattato sistemi Teton transgenici per l'utilizzo in zebrafish, che facilitano temporalmente e l'espressione genica spazialmente controllata che si aggiunge sintonizzabile e reversibile ^3-5.

Il sistema di Teton qui utilizzato comprende una linea pilota transgenica (TetActivator), in cui un Doxiciclina (DOX) -inducible attivatore trascrizionale (migliorato transattivatore tetraciclina inverso, irtTA, breve Teta) è sotto il controllo di sequenze regolatorie genomiche tessuto-specifici. In secondo luogo, esso richiede una linea transgenica responder (TetResponder) che ospita un gene di interesse sotto il controllo trascrizionale del gestore tetraciclina (Tet elemento di risposta; tetre) (Figura 1A). Pertanto, l'uso di combinazioni specifiche di linee TetActivator e TetResponder consente condizionale tessuto-specificomanipolazione fic dell'espressione genica.

Abbiamo recentemente utilizzato il sistema di Teton a sondare per le funzioni di tessuto-specifici di Wnt segnalazione / beta-catenina nell'adulto rigeneranti coda zebrafish fin ^3. Nel protocollo descritto qui si descrive un flusso di lavoro per la messa a punto e l'uso del sistema di Teton in zebrafish, in particolare per gli studi di rigenerazione fin. Questo include le istruzioni dettagliate su come generare linee TetActivator e TetResponder transgeniche stabili e di un protocollo per l'induzione transgene in embrioni e zebrafish adulto. Inoltre, si descrivono tecniche per la verifica dell'espressione genica tessuto-specifica nel rigenerato aletta, compreso un protocollo per la preparazione di criosezioni di pinne zebrafish adulti. Inoltre, si discute considerazioni per la progettazione del transgene TetActivator, la scelta di un metodo di transgenesi e rilevamento di espressione TetResponder. Quindi, l'obiettivo generale di questo protocollo è quello di servire da modelloprevista per il montaggio di un sistema téton funzionale zebrafish per ottenere l'espressione genica condizionale tessuto-specifico, che può essere applicato a qualsiasi tessuto di interesse.

Abbiamo creato un vettore TetActivator consentendo I-SCEI o generazione Tol2 mediata delle linee TetActivator stabili utilizzando sequenze di regolazione genomica brevi (frammenti enhancer; Weidinger laboratorio banca dati plasmide no 1247;. Figura 1B). Questo costrutto contiene una cassetta TetActivator consistente della variante mutante M2 del dominio repressore Tet inverso fuso con il virus Herpes simplex VP16 transattivazione dominio derivato 3F [irtTAM2 (3F)]. Espressione dei TetActivator (TETA) può essere facilmente monitorato dal momento che è co-espressa con il fluoroforo AmCyan dalla stessa griglia di lettura aperta; un peptide P2A media ribosomiale per saltare, che dovrebbe portare la produzione di Teta e AmCyan proteine ​​separate a un rapporto 1: 1 ^5,6. Il costrutto contiene anche un poylinker 5 'del Tcassette etActivator per facilitare l'inserimento di genomica sequenze regolatrici di interesse utilizzando metodi di clonazione convenzionali.

Inoltre, abbiamo creato un costrutto costituito dal cassetto sopra descritto TetActivator più una cassetta di selezione kanamicina (Weidinger database di plasmide laboratorio no 1180;. Figura 1C), che possono essere ricombinati in un cromosoma artificiale batterico (BAC) contenente una grande regione genomica ( di solito nel codone di inizio di un gene la cui espressione modello deve essere imitata dal transgene). Entrambi i costrutti sono disponibili presso il laboratorio Weidinger su richiesta.