שימוש במערכת טיטון לחקר מולקולרי מנגנוני התחדשות דג הזברה
Summary
Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.
Abstract
The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta–catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.
Introduction
דג הזברה הוא אורגניזם מודל חוליות מבוסס היטב ללמוד היבטים רבים של פיתוח, פיזיולוגיה, מחלות, והתחדשות. עם האימוץ הגובר של דג הזברה כמודל לתהליכי פוסט-עובריים ביולוגיים, כלים ניסיוניים למניפולציה של ביטוי גנים או מסלולי איתות מושרה, רקמות ספציפיות הפכו חשוב יותר ויותר. במיוחד, מחקרים לאיברים והתחדשות תוספת בדג זברה מבוגרת סובלים ממחסור בכלים לניתוח של דרישות מרחב ובזמן של מסלולי איתות בתהליכי התחדשות אלה.
נכון לעכשיו, שלוש מערכות שונות שימשו להשגת ביטוי מותנה, רקמות ספציפיות גנים בהתחדשות איברים של דג הזברה מבוגרת: מערכת טיטון מערכת Cre-לקס, ביטוי פסיפס של transgenes מושרה חום-הלם באמצעות transgenesis הגופנית בתיווך transposon, ו1 -3. טיטון מתייחס לגרסה של טטרציקלין-המשךמערכת התגלגלה תעתיק הפעלה, שבו הביטוי מופעל בנוכחות טטרציקלין האנטיביוטיקה או נגזרת, למשל דוקסיציקלין. מערכת Cre-לקס, כפי שעד כה השתמש בדגים בוגרים, מסתמכת על recombinase שליטת טמוקסיפן Cre (CreERT2), הביטוי שהוא מוגבל במרחב על ידי גורמי רגולציה רקמות ספציפיות. ההסרה מונעת-Cre של קלטת STOP מאפשרת ביטוי של הגן של עניין מונע על ידי אמרגן שצריכה להיות פעיל בכל סוגי התאים 1. יצירה בתיווך transposon של transgenes הגופני הביע mosaically מספקת מערכת לביטוי transgene מושרה בשושלות תאים בודדות. הזרקה של עוברי דג הזברה עם transposon Tol2 נושא גן של עניין בשליטת תעתיק של תוצאות אמרגן הלם חום באנשי chimeric בדרך כלל נושאים את הגן רק בשושלות תאים נפרדות של איבר התחדשות 2. בעוד שני המערכות מאפשרות לרקמות SPE המותנהביטוי גני cific, מערכת Cre-לקס הוא לא הפיכה, ואת האסטרטגיה באמצעות תיוג משובט מבוסס transposon סובלת מהטבע סטוכסטיים שלה. לפיכך, אנו ואחרים לאחרונה מותאמים מערכות מהונדסים טיטון לשימוש בדג זברה, המאפשרות באופן זמני וביטוי גנים במרחב שבשליטה שהוא במתכונן בנוסף ו3-5 הפיכים.
מערכת טיטון משמשת כאן כוללת קו מהונדס נהג (TetActivator) שבדוקסיציקלין (DOX) activator תעתיק -inducible (שיפור transactivator ההפוך טטרציקלין, irtTA, Teta הקצר) הוא תחת שליטה של רצפים רגולטוריים הגנומי רקמות ספציפיות. שנית, היא דורשת קו מגיב מהונדס (TetResponder) שמטפח גן של עניין בשליטת תעתיק של מפעיל טטרציקלין; (איור 1 א) (אלמנט תגובת ט TetRE). לפיכך, השימוש בשילובים מסוימים של קווי TetActivator וTetResponder מאפשר לרקמות ספציפיות מותנותמניפולציה פיק של ביטוי גנים.
יש לנו לאחרונה ניצלתי את מערכת טיטון לחקור לפונקציות רקמות הספציפיות של איתות / בטא קטנין Wnt במבוגרי התחדשות זנב דג הזברה סנפיר 3. בפרוטוקול המתואר כאן אנו מתארים את זרימת עבודה להקמה ושימוש במערכת טיטון בדג זברה, בפרט ללימודים של התחדשות סנפיר. זה כולל הוראות מפורטות על איך ליצור קווי TetActivator וTetResponder מהונדסים יציבים ופרוטוקול לזירוז transgene בעוברים ודג זברה מבוגרת. יתר על כן, אנו מתארים טכניקות לאימות ביטוי רקמות ספציפיות גנים בלהתחדש הסנפיר, כולל פרוטוקול להכנת cryosections של סנפירי דג הזברה מבוגרים. בנוסף, אנו דנים שיקולים לעיצוב של transgene TetActivator, הבחירה של שיטת transgenesis, וזיהוי של ביטוי TetResponder. לפיכך, המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לשמש כתכניתלהגדרה-עד מערכת טיטון פונקציונלית בדג הזברה להשיג ביטוי מותנה רקמות ספציפיות גן, אשר יכול להיות מיושם על כל רקמות של עניין.
יצרנו וקטור TetActivator מאפשר לאני-SCEI או דור תיווך Tol2 של קווי TetActivator יציבים באמצעות רצפים רגולטוריים הגנומי קצרים (שברים משפר; מסד נתוני פלסמיד מעבדה וייגינגר לא 1,247;. איור 1). מבנה זה מכיל קלטת TetActivator בהיקף של גרסת המוטציה M2 של תחום זה מדכא את ההפוך ט התמזגו עם תחום נגזרים 3F transactivation VP16 וירוס הרפס סימפלקס [irtTAM2 (3F)]. ביטוי של TetActivator (Teta) יכול להיות במעקב בקלות שכן הוא עם AmCyan fluorophore מאותה מסגרת קריאה פתוחה הביע שיתוף; פפטיד p2a מתווך דילוג ריבוזומלי, שאמור לגרום לייצור של תטא וAmCyan חלבונים נפרדים של 1: 5,6 יחס 1. המבנה מכיל גם poylinker 5 'של Tקלטת etActivator כדי להקל על החדרה של רצפים רגולטוריים הגנומי של עניין באמצעות שיטות שיבוט קונבנציונליות.
בנוסף, יצרנו מבנה המורכב של הקלטת מעל תיארה TetActivator בתוספת קלטת בחירת Kanamycin (מסד נתונים פלסמיד מעבדה וייגינגר לא 1,180;. איור 1 ג), שבו ניתן recombined לתוך כרומוזום בקטריאלי מלאכותי (BAC) המכילה אזור הגנומי גדול ( בדרך כלל לקודון ההתחלה של גן הביטוי שתבנית היא לחיקוי על ידי transgene). שני המבנים זמינים מהמעבדה וייגינגר על פי דרישה.
Protocol
Representative Results
Discussion
יש דג הזברה המבוגר יכולת מדהימה להתחדש בהצלחה רב איברים ואיברים פנימיים. הבנה מעמיקה של המנגנונים המולקולריים ותאיים המעורבים דורשת ניתוח רקמות הספציפיות של פונקציות גן ומסלולי איתות. לקראת זה, מערכת טיטון מספקת כלי יעיל לביטוי גנים מבוקר spatiotemporally בדג זברה עוברית ו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים כריסטה האזה, דוריס וובר ובריג'יט Korte לקבלת סיוע טכני. עבודה במעבדה וייגינגר נתמכת על ידי מענקים של דויטשה Forschungsgemeinschaft WE 4223 / 3-1, אנחנו 4223 / 4-1 ועל ידי Gesellschaft für דויטשה Kardiologie באמצעות אוסקר-לאפ-Stipendium וקלאוס-גיאורג אונד Sigrid- Hengstberger-Forschungsstipendium.
Materials
| Breeding boxes | Aqua Schwarz | AquaBox 1 | |
| Compound fluorescent microscope | e.g. Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | to image fluorescent tissue sections |
| Confocal microscope | e.g. Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | to image fluorescent tissue sections |
| Cryostat | e.g. Leica, Thermo-Scientific | varies with the manufacturer | for cryosectioning |
| 4’, 6- diamidino-2-phenylinodole (Dapi) | Sigma-Aldrich | D9542 | use 1/5000 in PBS for visualization of nuclei |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | D9891 | prepare stocks in 50% EtOH at 50 mg/ml (97 mM) for TetResponder induction |
| E3 embryo medium | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2· 2 H2O, 0.33 mM MgSO4·7 H2O, 0.2 ‰ (w/v) methylene blue, pH 6.5 for embryo/larvae husbandry |
||
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | 4 % (w/v) paraformaldehyde in PBS, pH 7.5 for fixation |
| 1x Phosphat-buffer saline (PBS) | 1.7 mM KH2PO4, 5.2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7.5 | ||
| 1x Phosphat-buffer saline + Tween 20 (PBT) | 1x PBS with 0.1 % Tween 20 | ||
| Superfrost Ultra Plus adhesion microscope slides | Thermo Scientific | 1014356190 | for collection of tissue sections |
| Stereo fluorescent microscope | e.g. Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | for fluorescence-based genotyping |
| Thermocycler | e.g. Biorad, Applied Biosystems | varies with the manufacturer | for PCR-based genotyping |
| Tissue freezing medium (TFM) | Triangel Biomedical Sciences | TFM-C | for embedding of tissue samples |
| Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzoate-methane sulfonate/MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | for anesthesia use at 1 mg/ml in E3 embryo medium |
References
- Fang, Y., et al. Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13416-13421 (2013).
- Tryon, R. C., Johnson, S. L. Clonal analysis of kit ligand a functional expression reveals lineage-specific competence to promote melanocyte rescue in the mutant regenerating caudal fin. PloS one. 9 (7), e102317 (2014).
- Wehner, D., et al. Wnt/beta-catenin signaling defines organizing centers that orchestrate growth and differentiation of the regenerating zebrafish caudal fin. Cell Rep. 6 (3), 467-481 (2014).
- Huang, C. J., et al. Conditional expression of a myocardium-specific transgene in zebrafish transgenic lines. Dev Dyn. 233 (4), 1294-1303 (2005).
- Knopf, F., et al. Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).
- Provost, E., Rhee, J., Leach, S. D. Viral 2A peptides allow expression of multiple proteins from a single ORF in transgenic zebrafish embryos. Genesis. 45 (10), 625-629 (2007).
- Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nat Protoc. 6 (12), 1998-2021 (2011).
- Bussmann, J., Schulte-Merker, S. Rapid BAC selection for tol2-mediated transgenesis in zebrafish. Development. 138 (19), 4327-4332 (2011).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. (27), (2009).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6 (4), e18556 (2011).
- Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 53 (2), 192-204 (2012).
- Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin. J Vis Exp. (61), (2012).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), 610 (2007).
- Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
- Suster, M. L., Kikuta, H., Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system. Methods Mol Biol. , 56141-56163 (2009).
- Grabher, C., Wittbrodt, J. Meganuclease and transposon mediated transgenesis in medaka. Genome Biol. 8, (2007).
