Utilisation du système de Teton pour étudier les mécanismes moléculaires de la régénération du poisson zèbre
Summary
Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.
Abstract
The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta–catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.
Introduction
Le poisson zèbre est un modèle vertébré organisme bien établi pour étudier de nombreux aspects du développement, de la physiologie, de la maladie, et la régénération. Avec l'adoption croissante de poisson zèbre comme un modèle pour les processus biologiques post-embryonnaires, des outils expérimentaux pour la manipulation inductible, tissu-spécifique de l'expression des gènes ou des voies de signalisation sont devenus de plus en plus importante. En particulier, des études sur l'orgue et la régénération appendice chez le poisson zèbre adultes ont souffert d'un manque d'outils pour la dissection des exigences spatio-temporelles de voies de signalisation au cours de ces processus de régénération.
Actuellement, trois systèmes différents ont été utilisés pour atteindre conditionnelle, expression tissu-spécifique gène dans la régénération des organes de poisson zèbre adulte: le système Cre-lox, expression mosaïque de choc thermique transgènes inductibles utilisant transposon médiée par transgenèse somatique, et le système de Teton 1 -3. Teton se réfère à une variante d'un tétracycline suiteSystème d'activation de la transcription roulé, où l'expression est activée en présence de l'antibiotique tétracycline ou un de ses dérivés, par exemple la doxycycline. Le système Cre-lox, comme il a jusqu'à présent été utilisé chez les poissons adultes, repose sur une recombinase Cre tamoxifène contrôlée (CreERT2), dont l'expression est restreinte spatialement par des éléments régulateurs spécifiques d'un tissu. Enlèvement mécanique de Cre une cassette d'arrêt facilite l'expression du gène d'intérêt entraîné par un promoteur qui devraient être actifs dans tous les types cellulaires 1. création de transposon à médiation par des transgènes exprimés somatiques mosaically fournit un système pour l'expression inductible du transgène dans des lignées cellulaires individuelles. L'injection d'embryons de poisson zèbre avec un transposon Tol2 portant un gène d'intérêt sous contrôle transcriptionnel d'un choc thermique résultats de promoteurs chimériques chez les individus portant généralement le transgène seulement dans les lignées de cellules discrètes d'un organe 2 de régénération. Bien que les deux systèmes permettent conditionnelle tissu spel'expression du gène cifique, le système Cre-lox est pas réversible, et de la stratégie en utilisant l'étiquetage clonale à base de transposons souffre de sa nature stochastique. Ainsi, nous et d'autres avons récemment adapté systèmes de Teton transgéniques pour une utilisation chez le poisson zèbre, qui facilitent le temps et dans l'expression des gènes dans l'espace contrôlé qui est en plus réglable et réversible 3-5.
Le système de Teton utilisé ici comprend une ligne de pilote transgénique (TetActivator) dans lequel un doxycycline (DOX) activateur transcriptionnel inductible par (amélioré transactivateur tetracycline inverse, irtTA, court TetA) est sous le contrôle de séquences régulatrices génomiques spécifiques de tissus. Deuxièmement, il faut une ligne de répondeur transgénique (TetResponder) qui abrite un gène d'intérêt sous le contrôle transcriptionnel de l'opérateur de la tétracycline (élément de réponse Tet; Tetre) (figure 1A). Ainsi, l'utilisation de combinaisons spécifiques de lignes TetActivator et TetResponder permet conditionnelle tissu-spécifiquemanipulation de fic de l'expression génique.
Nous avons récemment utilisé le système de Teton pour sonder pour des fonctions spécifiques de tissus de signalisation Wnt / beta-caténine dans l'adulte régénération queue de poisson zèbre ailette 3. Dans le protocole décrit ici, nous décrivons un flux de travail pour les set-up et l'utilisation du système Teton chez le poisson zèbre, en particulier pour les études de la régénération des nageoires. Cela inclut des instructions détaillées sur la façon de générer TetActivator et TetResponder lignées transgéniques stables et un protocole pour l'induction du transgène dans les embryons de poisson zèbre et adulte. En outre, nous décrivons les techniques de vérification de l'expression du gène tissu-spécifique dans le régénérer fin, y compris un protocole pour la préparation de cryosections d'ailerons de poisson zèbre adultes. En outre, nous discutons de considérations pour la conception du transgène TetActivator, le choix d'une méthode de transgénèse, et la détection de l'expression TetResponder. Par conséquent, l'objectif global de ce protocole est de servir de modèlepour la mise en place d'un système de Teton fonctionnelle chez le poisson zèbre pour obtenir l'expression du gène tissu-spécifique conditionnelle, qui peut être appliquée à tout tissu d'intérêt.
Nous avons créé un vecteur permettant TetActivator pour I-Scel ou génération Tol2 à médiation par des lignes de TetActivator stables utilisant des séquences régulatrices courtes (fragments génomiques d'amplificateur; Weidinger base de plasmide d'aucun laboratoire 1247;. La Figure 1B). Ce produit d'assemblage contient une cassette constituée du TetActivator variante mutant M2 du domaine répresseur Tet inverse condensé avec le virus de l'herpès simplex VP16 domaine de transactivation dérivé 3F [irtTAM2 (3F)]. L'expression de la TetActivator (TETA) peut être facilement surveillée car il est co-exprimé avec l'AmCyan de fluorophore dans le même cadre de lecture ouvert; un peptide p2a médiateur ribosomique à sauter, qui devrait aboutir à la production de TetA et AmCyan que les protéines séparées à un ratio de 1: 5,6 1. Le produit d'assemblage contient également un poylinker 5 'du TCassette etActivator pour faciliter l'insertion de séquences régulatrices du génome d'intérêt en utilisant des procédés de clonage classiques.
En outre, nous avons créé un produit d'assemblage constitué de la cassette décrite ci-dessus TetActivator plus une cassette de sélection à la kanamycine (Weidinger laboratoire base de données de plasmide non 1180;. La figure 1C), qui peut être recombiné dans un chromosome artificiel bactérien (BAC) contenant une grande région génomique ( habituellement dans le codon d'initiation d'un gène dont l'expression motif doit être imité par le transgène). Les deux constructions sont disponibles auprès du laboratoire Weidinger sur demande.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le poisson zèbre adulte a une étonnante capacité à se régénérer avec succès de nombreux organes internes et des appendices. Une compréhension approfondie des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués requiert une analyse spécifique du tissu des fonctions des gènes et voies de signalisation. Dans ce sens, le système de Teton fournit un outil efficace pour l'expression du gène spatiotemporellement contrôlée chez le poisson zèbre embryonnaire et adulte. Les constructions du système de Teton e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Christa Haase, Doris Weber et Brigitte Korte pour l'assistance technique. Le travail dans le laboratoire Weidinger est financé par des subventions de la Deutsche Forschungsgemeinschaft WE 4223 / 3-1, WE 4223 / 4-1 et par la Deutsche Gesellschaft für Kardiologie via un Oskar-Lapp-Stipendium et Klaus-Georg-und-Sigrid- Hengstberger-Forschungsstipendium.
Materials
| Breeding boxes | Aqua Schwarz | AquaBox 1 | |
| Compound fluorescent microscope | e.g. Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | to image fluorescent tissue sections |
| Confocal microscope | e.g. Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | to image fluorescent tissue sections |
| Cryostat | e.g. Leica, Thermo-Scientific | varies with the manufacturer | for cryosectioning |
| 4’, 6- diamidino-2-phenylinodole (Dapi) | Sigma-Aldrich | D9542 | use 1/5000 in PBS for visualization of nuclei |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | D9891 | prepare stocks in 50% EtOH at 50 mg/ml (97 mM) for TetResponder induction |
| E3 embryo medium | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2· 2 H2O, 0.33 mM MgSO4·7 H2O, 0.2 ‰ (w/v) methylene blue, pH 6.5 for embryo/larvae husbandry |
||
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | 4 % (w/v) paraformaldehyde in PBS, pH 7.5 for fixation |
| 1x Phosphat-buffer saline (PBS) | 1.7 mM KH2PO4, 5.2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7.5 | ||
| 1x Phosphat-buffer saline + Tween 20 (PBT) | 1x PBS with 0.1 % Tween 20 | ||
| Superfrost Ultra Plus adhesion microscope slides | Thermo Scientific | 1014356190 | for collection of tissue sections |
| Stereo fluorescent microscope | e.g. Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | for fluorescence-based genotyping |
| Thermocycler | e.g. Biorad, Applied Biosystems | varies with the manufacturer | for PCR-based genotyping |
| Tissue freezing medium (TFM) | Triangel Biomedical Sciences | TFM-C | for embedding of tissue samples |
| Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzoate-methane sulfonate/MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | for anesthesia use at 1 mg/ml in E3 embryo medium |
References
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