Gebruik van de Teton systeem om te studeren moleculaire mechanismen van zebravis Regeneratie

De zebravis is een gevestigde gewervelde modelorganisme diverse aspecten van de ontwikkeling, fysiologie, ziekte en regeneratie te bestuderen. Met de groeiende goedkeuring van de zebravis als model voor post-embryonale biologische processen, experimentele instrumenten voor induceerbare, weefselspecifieke manipulatie van genexpressie of signaalwegen zijn steeds belangrijker geworden. Vooral studies naar orgel en aanhangsel regeneratie bij volwassen zebravis hebben geleden onder een gebrek aan tools voor dissectie van de ruimte-tijd eisen van signaalroutes tijdens deze regeneratieve processen.

Momenteel zijn drie verschillende systemen gebruikt om conditionele, weefselspecifieke genexpressie in regenereren organen van volwassen zebravissen bereiken: het Cre-lox-systeem, mozaïek expressie van heat-shock induceerbare transgenen middels transposon gemedieerde somatische transgenese en de Teton systeem ^{1 -3.} TETON verwijst naar een variant van een tetracycline-contgerolde transcriptionele activeringssysteem, waarbij expressie wordt geactiveerd in aanwezigheid van het antibioticum tetracycline of een derivaat, bijvoorbeeld doxycycline. De Cre-lox-systeem, zoals dat tot nu toe gebruikt bij volwassen vis, gebaseerd op een Tamoxifen-gecontroleerde Cre recombinase (CreERT2), waarvan de expressie ruimtelijk beperkt weefselspecifieke regulerende elementen. Cre aangedreven verwijdering van een STOP cassette vergemakkelijkt expressie van het gen van belang aangestuurd door een promoter die actief is in alle celtypes ¹ moet zijn. Transposon gemedieerde creëren van mosaically expressie somatische transgenen verschaft een systeem voor induceerbare transgenexpressie in afzonderlijke cellijnen. Injectie van zebravisembryo's met een Tol2 transposon die een gen van belang onder de transcriptionele controle van een heat shock promoter resulteert in chimere individuen kenmerkend die het transgen slechts in discrete cellijnen van een regenererende orgaan ^2. Hoewel beide systemen zorgen voor voorwaardelijke tissue-spefieke genexpressie, het Cre-lox systeem is niet omkeerbaar en de strategie met transposon gebaseerde klonen etikettering lijdt zijn stochastische natuur. Zo hebben wij en anderen recent aangepast transgeen Teton voor toepassing in de zebravis, waarbij tijd en ruimte-gestuurde genexpressie die bovendien instelbaar en omkeerbaar ^3-5 vergemakkelijken.

De Teton systeem hier gebruikt omvat een transgene driver lijn (TetActivator) waarin een Doxycycline (DOX) -induceerbare transcriptie activator (verbeterde omgekeerde tetracycline transactivator, irtTA, korte TETA) is onder controle van de weefsel-specifieke genomische regulatoire sequenties. Ten tweede vereist een transgene lijn responder (TetResponder) dat een gen van belang onder transcriptionele controle van de tetracycline operator herbergt (Tet responselement, Tetre) (figuur 1A). Zo is het gebruik van specifieke combinaties van TetActivator en TetResponder lijnen maakt voorwaardelijke weefsel-specific manipulatie van genexpressie.

We hebben onlangs gebruik gemaakt van de Teton systeem om sonde voor weefsel-specifieke functies van Wnt / beta-catenine signalering in de volwassen regenereren zebravis staartvin ^3. In het protocol hier geschetste beschrijven we een workflow voor de set-up en het gebruik van de Teton systeem in de zebravis, met name voor studies fin regeneratie. Deze bevat gedetailleerde instructies over hoe stabiele transgene TetActivator en TetResponder lijnen te genereren en een protocol voor transgene inductie bij embryo's en volwassen zebravissen. Verder beschrijven we technieken voor de controle van weefselspecifieke genexpressie in de vin regenereren, omvattende een protocol voor de bereiding van cryosecties van volwassen zebravis vinnen. Daarnaast bespreken we overwegingen voor het ontwerp van de TetActivator transgen, de keuze van een transgenese methode en detectie van TetResponder expressie. Vandaar dat het algemene doel van dit protocol is om te dienen als een blauwdrukvoor het opzetten van een functioneel Teton systeem zebravis voorwaardelijke weefselspecifieke genexpressie, die kunnen worden toegepast om een ​​weefsel van belang te bereiken.

We hebben een TetActivator vector waardoor I-SceI of Tol2-bemiddelde generatie van stabiele TetActivator lijnen met behulp van korte genomische regulerende sequenties gemaakt (enhancer fragmenten; Weidinger lab plasmide databank geen 1247;. Figuur 1B). Dit construct bevat een TetActivator cassette bestaande uit het M2 mutant variant van de reverse Tet-repressor gefuseerd met het herpes simplex virus VP16 transactivatiedomein-derivaat 3F [irtTAM2 (3F)]. Expressie van het TetActivator (TETA) eenvoudig worden gecontroleerd omdat het gecoëxpresseerde de fluorofoor AmCyan van het open leesraam daarvan; Een P2A peptide medieert ribosomale skipping, wat moet leiden tot de productie van TETA en AmCyan als afzonderlijke eiwitten in een 1: 1 verhouding van ^5,6. Het construct bevat ook een poylinker 5 'van het TetActivator cassette genomische insertie van regulerende sequenties van belang onder toepassing van gebruikelijke werkwijzen klonering vergemakkelijken.

Die kan worden gerecombineerd in een bacterieel kunstmatig chromosoom (BAC) die een grote genomische regio (; Daarnaast hebben we een construct bestaande uit de bovenbeschreven TetActivator cassette plus een kanamycine selectiecassette (. Figuur 1C Weidinger lab plasmide gegevensbestand geen 1180) gecreëerd gewoonlijk in de startcodon van een gen waarvan de expressie patroon moet worden nagebootst door het transgen). Beide constructies zijn verkrijgbaar bij de Weidinger lab op verzoek.