Escalável placa de 96 poços Baseado iPSC Cultura e Produção Usando um sistema de manipulação robótica Líquido

Desenvolvimento de uma haste robótico plataforma de cultura de células placa base. A demanda por iPSCs está crescendo devido a sua utilidade no desenvolvimento de medicamentos e medicina regenerativa. No entanto, a produção escalável tem se concentrado em suspensão de cultura de 32 em equipamentos relativamente complexa que exclui muitos pesquisadores e diverge de métodos de cultura aderentes estabelecidos. Em vez de alterar drasticamente-tronco com base métodos de cultura de células de placas comprovada, tais como a mudança para uma cultura de suspensão ou usando um microcarrier, nós nos concentramos em miniaturização e automatizar nossas técnicas aderentes existentes cultura da IPSC. O primeiro objectivo era o de automatizar a alimentação e para normalizar passaging todo o processo de cultura. Uma plataforma capaz de escala-se rapidamente com a tecnologia existente também foi exigido. Para atingir estes objectivos de um método foi concebido para células estaminais em cultura numa placa de 96 poços, utilizando um sistema automatizado de manuseamento de líquidos (Figura 1). O protocols aqui desenvolvidos com o robô de manipulação de líquidos para a alimentação de passagem e que não requerem um passo de centrifugação ou a monitorização contínua por um técnico. Estes protocolos foram desenvolvidos com duas linhas alimentadoras IPSC livres; um derivado de fibroblastos e o outro a partir de células adiposas 33. O sistema controlado por computador de manipulação de líquidos (Figura 1A) ser constituído por um leito que se move frente e para trás. A cama tem nove, aproximadamente 5 x 3,3 polegadas recessos numeradas com pressão clipes de retenção para aceitar placas de cultura celular padrão, reservatórios líquidos e outro hardware personalizado. As pipetas movimentos de cabeça esquerda para a direita (perpendicular ao movimento cama), bem como para cima e para baixo. Juntamente com a cama, a cabeça pipeta pode ser programado para remover ou entregar mídia em qualquer lugar na cama depois de pegar as pontas das pipetas de um rack recarregáveis. Se necessário, cada um dos 96 poços podem ser mantidas separadas para eliminar a contaminação cruzada. Na configuração atual, 0 a200 ul de meios de comunicação podem ser movidos por cada ponta da cabeça da pipeta, mas outras são possíveis intervalos de volume com base no tamanho da ponta. Quando passaging células estaminais em placas standard, enzimática ou dissociação química requer tipicamente a incubação a 37 ° C. Os testes iniciais confirmaram dissociação com um reagente de dissociação proteolítica e colagenolítica ou um reagente à base de EDTA melhor realizada a 37 ° C do que a temperatura ambiente tanto tempo para a dissociação e a homogeneidade do tamanho das colónias produzidas pelas nossas duas linhas de 96 poços IPSC (dados não mostrados). Para automatizar o processo de divisão e evitar placas entrando e saindo de uma incubadora, rampas inclinadas, temperatura controlada que aceitam e reprodutível posicionar placas de cultura padrão foram construídas (Figura 1A). Quando as rampas foram aquecidos a 37 ° C, um reagente de dissociação proteolítica e colagenolítica ou dissociação com base EDTA dos iPSCs de placas de 96 poços foi comparável para placas colocadas numa incubadora de 37 ° C (dados not mostrado). As rampas inclinadas também foram utilizadas para permitir pontas de pipeta para recolher o conteúdo de um poço inteiro (menos de 5 ul volume residual) ao atingir o ponto mais baixo dentro do poço enquanto que a aspiração a partir de uma placa plana deixou um volume residual de cerca de 10-15 ul, resultando na perda de células. A rampa inclinada também permitiu aos poços a serem lavados (triturado) por meios de ejectar no topo do poço inclinado e recolhê-lo na parte inferior. Robótico cultura de células estaminais no formato de placa de 96 poços; alimentação e passaging. Cultura de iPSCs que utilizam o sistema de manipulação de líquidos robótico tem duas fases; passagem e alimentação. Quando uma colónia está pronto para a passagem, que é dividida numa proporção pré-determinada para semear uma nova placa que é então transmitido a intervalos regulares até que esteja pronto para a passagem de novo (Figura 1B). Culturas congeladas ou não de 96 poços pode ser iniciado no formato de 96 poços e entrar imediatamente na passagem / feedciclo. As células que não são usados ​​para manter a colónia, que é a maior parte de uma placa, são colhidas para outros usos e representa o componente de produção deste sistema. Alimentação de 96 poços cultivadas iPSCs é realizado quando a totalidade ou parte do meio é removido após um período de cultura e depositado num reservatório de resíduos. Em seguida, o meio fresco é dividido em alíquotas para a mesma placa. O robô pode usar novas dicas e calhas de mídia para segregar cada bem para a alimentação inteiramente customizável, incluindo misturando meios condicionados com as novas mídias. Passagem típica de células estaminais requer um método de dissociação e, muitas vezes um passo de centrifugação. Os protocolos descritos aqui pretende normalizar dissociação e eliminar centrifugação. O protocolo de passagem começa quando o robô proporciona reagente de dissociação para placas de 96 poços montado em 37 ° C rampas inclinadas. Depois de um tempo pré-definido, as células dissociadas são recolhidos com uma ação de lavagem onde o usuário tem control sobre a posição, a repetição, o volume ea taxa de trituração. Enzima tempo, a taxa de trituração e o número de repetições trituração foram suficientes para variar o tamanho da colónia dissociado e homogeneidade (Figura 2), mas cada parâmetro é ajustável para se adaptar necessidades de uma determinada linha celular. Este controle remove variabilidade introduzida pelos técnicos que pipeta com taxas variáveis, posições e repetições. Uma vez que as células dissociadas são recolhidas e reunidas em um reservatório com meio fresco, eles são distribuídos para uma nova placa. Para evitar centrifugação e semeadura problemas de degradação de substrato ou morte celular devido à ação das enzimas, reagentes dissociação foi diluído para o ponto mínimo de dissociação aceitável que resultou na semeadura confiável. Esta técnica foi eficaz para um reagente de dissociação proteolítica e colagenolítica em meio mTeSR1 34, que tem um teor relativamente elevado de proteína, mas também eficaz em meios de baixa proteína como Essencial-8 35 </sup>, ambos os quais são compatíveis com o presente sistema (E8 dados não mostrados). Controlar a densidade de semeadura de células-tronco após a passagem é fundamental para a cultura de células-tronco de rotina e bem sucedida. Sementeira muito baixa ou elevada pode resultar na diferenciação ectópica e perda de pluripotência além de causar intervalos irregulares passagem. A cultura de células estaminais típica baseia-se na razão de divisão onde um poço de uma placa de 6 poços é utilizada para semear toda uma nova placa de 6 poços (a 1: 6 de divisão). Com a manipulação robô líquido esta razão pode ser ajustada de acordo com as necessidades do utilizador (por exemplo, 1: 6, 1: 9, 1:12, etc) e tem mais influência sobre o intervalo de passagem. O robô pode colher menos de uma coluna, uma coluna inteira (8 poços), ou mais de uma coluna, dependendo das necessidades do usuário, que deve ser determinado empiricamente. As iPSCs adiposo e fibroblastos derivados mantido uma programação de alimentação regular com três dias passagem no quarto dia, quando dividiu 01:12. Neste caso, uma coluna foi colhido e utilizado para semear uma nova placa de 96 poços, criando uma separação 01:12 com cada ciclo (Figura 3A). Os restantes 11 poços foram então disponível para aplicações a jusante. Para recolher estes 11 poços de produção, o protocolo de passagem foi repetido excepto as células foram depositadas em uma calha de recolha. Alternativamente, as células podem ser deixadas na placa e usado directamente. Para conseguir passagem densidade de semeadura consistente para passagem sem contar, e manter uma programação divisão de rotina, os nossos protocolos de chamar para dividir o mesmo número pré-determinado de colunas quando a colônia está em uma densidade ideal para a passagem. Para ajudar os usuários a identificar a densidade adequada para a passagem, uma série de imagens foi gerado mostrando uma gama de densidades com uma densidade passagem ideal destaque (Figura 3B). Para determinar quando a passagem, um técnico examina sua placa e compara-o com a escala da imagem de densidade. A ideial densidade de passagem foi determinado a partir de cultura de tecido adiposo e os iPSCs fibroblastos derivados e verificou-se ser quando o espaço entre a maioria das colónias era cerca de 25% do diâmetro das colónias adjacente. É importante que as colónias de ser distribuído de forma homogénea. Este valor de separação de colónias correlaciona com a densidade máxima desejável porque um ciclo de alimentação adicional que resultaria em colónias que tocam, que é um gatilho para a diferenciação ectópica. Um protocolo necessário desenvolvido aqui aborda como iniciar uma cultura no formato de 96 poços e como repor uma cultura depois de um problema densidade. Quando uma nova cultura é iniciada, a melhor densidade de sementeira e número de ciclos de alimentação antes passaging são desconhecidos. Para garantir uma densidade utilizável após a sementeira, o robô distribui as células existentes ou descongelados através de uma placa de 96 poços numa diluição em série (Figura 4A). Exemplos de resultados de um tal gradiente são apresentados na Figura 4B-E. Depois de vários alimentaçãociclos, algumas colunas aproximar a densidade ideal para dividir, altura em que um técnico utiliza o robô para semear uma placa uniformemente diluído para iniciar a cultura regular. Este protocolo de gradiente de densidade também foi usada para restaurar intervalos regulares e passagem colónia homogeneidade de uma placa irregular. Se a passagem for atrasado ou faltado, densidade e tamanho da colônia tornar-se demasiado elevado, ao passo que se a passagem é muito cedo, densidade colônia é muito baixa e as colónias individuais podem tornar-se muito grande, sem ser distribuídos uniformemente em todo o bem. O protocolo de gradiente de densidade resolve estes problemas e permite que o usuário reinicie escolhendo um conjunto idealmente semeado de poços. Duas linhas de IPSC pluripotentes permaneceu após 3 meses de cultura robótico. Manutenção da pluripotencialidade de células-tronco podem ser adversamente afetados por condições de cultura 36,37. Para avaliar se adiposo e fibroblastos derivados linhas de IPSC (a-IPSC, f-iPSC, respectivamente) manteve pluripotency quando cultivadas roboticamente em placas de 96 poços por um período prolongado de tempo, as duas linhas foram cultivadas no líquido robô manipulação como descrito acima durante 3 meses e, em seguida, marcadores de pluripotência foram examinados. Para este período, ambas as linhas foram passadas com um reagente de dissociação proteolítica e colagenolítica maior do que 20 vezes, sem centrifugação. Placas de 96 poços a partir de uma fixo-iPSC e linhas F-IPSC coradas para Oct4 e Nanog exibiu acumulação nuclear destes marcadores enquanto que foi observada SSEA-4 na superfície da célula (Figura 5A-G). Isto é consistente com relatos prévios para iPSCs pluripotentes 38-41. Contracoloração com DAPI não revelou quaisquer células adicionais que não foram também positivos para os três marcadores de pluripotência. As anomalias cromossómicas são frequentemente observados durante a cultura de células estaminais 42,43 mas pode não afectar a distribuição de marcadores de pluripotência como aqueles mostrados na Figura 5A-G. Kanálise aryotype revelou ambas as linhas IPSC roboticamente passadas tinha 46 cromossomos normais, sugerindo que o método de cultura robótico não introduzir instabilidade cromossômica além do que normalmente poderia ocorrer (Figura 5 M-N). Para sondar a expressão de genes em células estaminais estabelecidas marcadores 1,41,44,45 nas linhas de IPSC roboticamente cultivadas, RNA total foi coletado em paralelo com a coloração e análise do cariótipo. Ambos os 96 poços da placa linhas IPSC teve expressão semelhante de marcadores de pluripotência NANOG, POU5F1 e Rex1 enquanto cardiomiócitos diferenciados de cada linha não fez, nem uma linha separada de fibroblastos dérmicos humanos (HDFS) (Figura 6). Os cardiomiócitos derivados de ambas as linhas foram MYL7 positivo enquanto os HDFs e células-tronco não expressou MYL7. Ambas as linhas de IPSC foram diferenciadas em cardiomiócitos com a molécula pequena, Wnt técnica da manipulação da via descrita recentemente 46 </sup>. Quando manchado, cardiomiócitos de ambas as linhas foram cTnT positiva com formação sarcomere claro (Figura 7). Diferenciação em cardiomiócitos no formato de 96 poços foi bem sucedida em mais de 80% dos poços (dados não mostrados). Em conjunto, estes dados sugerem 3 meses e mais de 20 passagens de cultura de células resultou em robótico cromossomicamente normais exibem um programa de transcrição consistente com pluripotência que também eram capazes de se diferenciarem em cardiomiócitos. Figura 1. Visão geral da robótica equipamentos de cultura de células-tronco e típica rotina de cultura da IPSC. (A) Robotic sistema de manuseio de líquidos mostrado com layout cama típica de 96 poços de cultura de células-tronco. Reagentes líquidos Novas pontas de pipeta estéreis (TIPS), recipiente de resíduos removível ponta (de resíduos), bem multi-trough autoclave para segurar necessários (Líquidos), placas de 96 poços estão posicionados um d suportado em uma temperatura controlada, rampa inclinada (placas de 96 poços), 8 canal de cabeça pipeta robótico que se move para a esquerda / direita e para cima / baixo (cabeça Pipet). Placa da tampa segurando cremalheira (PLHR). Os números de posição de cama mostrados na tabela abaixo. Cultura (B) Robotic iPSC tem duas fases: Alimentação e Passage. O ciclo de produção de células começa quando uma placa colônia está pronto para a passagem. O utilizador escolhe a proporção desejada para a passagem e as sementes robô um novo grupo de placas de 96 poços, em seguida alimentados a intervalos regulares até estar pronto para a passagem de novo. Quando as placas estão prontas para passagem, mais de cada placa não é utilizada para semear placas de colónias subsequentes e está disponível para outros usos, representando, assim, a fase de produção do sistema. As linhas celulares congeladas ou existentes podem ser introduzidas em qualquer momento e mantida no ciclo de alimentação / passagem. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. e_content "fo: manter-together.within-page =" always "> Figura 2. Parâmetros de manuseio de líquidos robóticos pode ser usado para controlar as características de colónias de dissociação IPSC. Cada imagem representativa mostra fibroblastos derivados iPSCs dissociados após o tratamento indicado enquanto ainda suspenso na 96 poços. (Linha superior, A – C) Tempo enzima, sem trituração. IPSCs derivadas de fibroblastos cultivadas em placas de 96 poços foram sujeitas a momentos de proteolítica e colagenolítica dissociação reagente de dissociação e sem trituração foi realizada aumentando robótico. (Middle Row, D – F) Taxa de trituração, 3 enzima minutos. As células foram expostas a três minutos de tratamento proteolítica e colagenolítica reagente de dissociação e, em seguida, 175 ul de meio de crescimento foi aplicado cada poço e pipetados para cima e para baixo uma vez, à taxa indicada. ^ l / s = p microlitroser segundo. (Linha de fundo, G – I) A trituração repetições, três minutos enzima, 160 l / seg. As células foram expostas a proteolítica e reagente dissociação colagenolítica durante 3 minutos, 175 ul meio de crescimento foi aplicado, então triturado em 160 l / seg para o número indicado de repetições. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3. adiposo típica e fibroblastos iPSC esquema de manutenção da colônia e uma série de imagens de densidade de colónia para determinar quando a passagem para manter um ciclo de alimentação / passagem regular. (A) Começando com uma adiposo ou de fibroblastos 96 poços colônia iPSC pronto para passagem, uma coluna de células foi passada sobre o robô sem centrifugação e diluiu-12 novas colunas que foram alimentados em intervalos específicos, posteriormente, até que a placa estava pronto para a passagem novamente. Para a produção de células, colunas não utilizados para manter a colónia foram passadas e recolhido para utilização subsequente. Qualquer número de colunas podem ser passadas para controlar a taxa de expansão. (B) Para determinar quando a passagem, uma série de imagens de densidade capturou cada 24 horas foi fornecido aos usuários. Na caixa de vermelho topo (dentro de 72 horas após a semeadura inicial) a colônia não é denso o suficiente para passagem e deve ser alimentada. Quando a densidade corresponde ao indicado no caixa verde (em ~ 96 horas), a colônia é em uma densidade ideal para a passagem. Por 120 horas, a colônia é demasiado denso para passagem e este cenário deve ser evitada. Este último pode ser resolvido com um gradiente de densidade de semeadura mas a cultura de rotina neste densidade é fortemente desencorajada. Barra branca é igual a 200? M. Por favor clique aqui para ver um versi maioresem dessa figura. Figura 4. 96 poços sistema robótico cultura permite aos utilizadores para iniciar culturas a partir de linhas de células congeladas ou activas e executar um gradiente de semeadura. (A) Uma solução de células é preparado pelo utilizador a partir de um banco de células congeladas ou após a colheita de uma cultura activa e colocado no robot. O sistema robótico em seguida, executa um protocolo de diluição em série para distribuir a solução inicial de células ao longo da placa de 96 poços com o gradiente de densidade distribuído pela coluna. (B – E) Exemplos de densidade celular a partir de quatro dos doze colunas de A, 48 h após o protocolo de gradiente de densidade de sementeira. Linhas brancas igualar 225 m. Por favor clique aqui para ver uma versão maior destafigura. Figura 5. pluripotência é mantida durante adiposo e fibroblastos derivadas linhas IPSC durante 96 poços para cultura robótico 22 (adiposo) ou 23 (fibroblasto) passagens (~ 3 meses). (A – G) adiposo e linhas celulares derivadas de fibroblastos IPSC foram roboticamente alimentados e passados ​​como descrito no texto, sem centrifugação em placas de 96 poços, durante 22 ou 23 passagens, em seguida, fixos e corados para marcadores de pluripotência Oct4, Nanog, ou SSEA4 de contraste com DAPI. Barra branca é igual a 100 um. (M – N). Culturas paralelas às descritas em A foram submetidos para análise do cariótipo que revelou um complemento normal de 46 cromossomos Por favor, clique aqui para ver uma versão maior oesta figura f. Figura 6. adiposo (96-A) e de fibroblasto (96-F) derivada iPSCs cultivadas durante mais de 20 passagens no formato de 96 poços robótico mantida a expressão do gene pluripotência e diferenciadas em cardiomiócitos. ARNm total foi extraído a partir de ambas as linhas de IPSC roboticamente cultivadas bem como cardiomiócitos diferenciada de ambas as linhas (CM-A = adiposos cardiomiócitos iPSC derivados, CM-F = derivado de fibroblastos iPSC cardiomiócitos, recolhido 14 dias após a indução da diferenciação) e utilizado para RT-PCR para sondar marcadores de pluripotência NANOG, POU5F1, Rex1, cardiomiócitos marcador MYL7 e controle de carga GAPDH. Fibroblastos dérmicos humanos (HDF) foram também recolhidos e utilizados como um não-IPSC controlo não cardiomiócitos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 7. de fibroblastos e tecido adiposo derivado iPSCs mantida a capacidade de se diferenciar em cardiomiócitos após a longo prazo de 96 poços de cultura robótico (A – H). Adiposo e iPSCs fibroblastos cultivadas no formato de 96 poços robótico para mais do que 20 passagens foram diferenciadas em cardiomiócitos . 14 dias após a indução de diferenciação, placa de 96 poços ligados cardiomiócitos foram dissociadas e novamente plaqueadas a baixa densidade em lâminas de vidro para a imunocoloração de troponina T (vermelho), F-actina (verde) e núcleos (azul). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. p_upload / 52755 / 52755fig8.jpg "/> Figura 8. Intensificação placa de cultura de células estaminais de 96 poços. Scale-se a produção de células estaminais depende do número de placas utilizadas para semear o grupo subsequente de placas. O usuário pode optar por manter um nível de produção por passagem o mesmo número de placas a cada oportunidade de dividir ou expandir a produção semeando mais placas. Por exemplo, no ciclo 0, uma placa de 96 poços é passadas para doze novas placas (ciclo 1), criando uma expansão de dobragem 12. Esta taxa pode ser mantida, se um dos doze placas é passadas para um novo conjunto de doze placas de ciclo (1-2) ou expandido por passagem de múltiplas placas de ciclo (2-3). Durante a passagem, quaisquer placas que não são utilizados para manter a colônia estão disponíveis para aplicações a jusante. Portanto, passaging 12 placas rotineiramente pode produzir um máximo de 144 placas em duas passagens: 12 para manutenção das colónias e 132 para outros usos."> Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 9. Eficiência de cultura em placa de 96 poços com base para a produção de células excede grandemente cultivo manual. Como observado na Figura 8, uma placa pode ser passadas para semear doze placas, que podem então ser passadas para placas de 144. Esta taxa de expansão pode ser conseguido de duas possibilidades de divisão. Um técnico requer cerca de 3,5 minutos para alimentar uma placa de 6 poços enquanto eles gastam cerca de 30 segundos com uma placa de 96 poços para examiná-lo no microscópio e colocá-lo no robô. Se o técnico está a levar 144 placas, eles vão gastar cerca de 1,2 placas de manipulação de RH ao alimentar com o robô Considerando que a cultura manual irá exigir um dedicado 8 horas para se alimentar. Por favor clique aqui para vIEW uma versão maior desta figura.