ロボット液体ハンドリングシステムを用いたiPS細胞培養および生産ベースのスケーラブルな96ウェルプレート

プレートの展開は、ロボットの幹細胞培養プラットフォームをベース。 性IPSCのための需要は、薬剤開発や再生医療におけるそれらの有用性に成長しています。まだスケーラブルな生産は、多くの研究者を除外し、確立された接着性の培養方法から分岐し、比較的複雑な装置で懸濁培養32に焦点を当てています。大幅にこのような浮遊培養への切り替えまたはマイクロキャリアを使用するなど、実績のあるプレートに基づく幹細胞培養法を変えるのではなく、私たちは、既存の接着性iPS細胞培養技術を小型化し、自動化に焦点を当てました。最初の目的は、全培養プロセスを標準化するために供給および継代を自動化することでした。既存の技術と迅速なスケールアップが可能なプラットフォームも必要でした。これらの目標を達成するための方法は、自動液体ハンドリングシステム（ 図1）を利用し、96ウェルプレート中で培養幹細胞に考案されました。 PROT供給および通過のための液体処理ロボットとここで開発ocolsは技術者による遠心分離工程または連続的な監視を必要としません。これらのプロトコルは、2フィーダーフリーのiPS細胞株を用いて開発されました。脂肪細胞33からの線維芽細胞およびその他に由来するもの。 コンピュータ制御された液体ハンドリングシステム（ 図1A）は、前面と背面に移動するフラットベッドで構成されています。ベッドは9、標準的な細胞培養プレート、液溜めおよびその他のカスタムハードウェアを受け入れるように圧力保持クリップと凹部の番号を付け、約5×3.3インチを持っています。ピペットヘッドが移動するだけでなく、上下（床運動に垂直な方向）左から右へ。一緒のベッドで、ピペットヘッドは、詰め替え可能なラックからピペットチップを拾った後、ベッドの上で任意の場所にメディアを削除するか、送出するようにプログラムすることができます。必要であれば、96ウェルのそれぞれは、クロスコンタミネーションを除去するために別々に維持することができます。本構成では、0〜200μlの培地をピペットヘッドの各先端により移動させることができるが、他のボリュームの範囲は、先端サイズに基づいて可能です。 標準プレート中の幹細胞を継代すると、酵素的または化学的解離は、典型的には37℃でのインキュベーションを必要とします。最初の試験は、タンパク質分解およびコラーゲン解離試薬または我々の2つの96ウェルiPS細胞株に対して生成さコロニーサイズの解離と均一に時間RTの両方よりも37℃でより良い実行EDTAベースの試薬と解離を確認した（データは示さず）。分割プロセスを自動化し、培養器の内外プレートの移動を回避するには、受け入れて、再現性の標準的な培養プレートを配置し、傾斜、温度制御されたランプは、（ 図1A）に建設されました。ランプは、37°C​​に加熱したときに、96ウェルプレートからのタンパク質分解およびコラーゲン解離試薬または性IPSCのEDTAベースの解離を、37℃のインキュベーターに入れ、プレートに匹敵した（データnOT）に示します。平板からの吸引が得られ、約10〜15マイクロリットルの残留量を残したのに対し、傾斜ランプは、ウェル内の最低点に達することによって（5μLの残量未満）ウェル全体の内容を収集するために、ピペットチップを有効にするために利用されましたセル損失で。傾斜ランプはまた、ウェルを洗浄し（粉砕し）ウェル傾斜の上部にメディアを吐出しておよび底部でそれを収集することができました。 96ウェルプレートフォーマットでの幹細胞の培養ロボット。供給および継代。 ロボット液体ハンドリングシステムを用いてiPS細胞の培養は、2つのフェーズを有します。通路と給電。コロニーが通過する準備ができたら、それが再び通過する準備ができている（ 図1B）まで、一定の間隔で供給され、新たなプレートに播種するために所定の比率で分割されます。凍結または非96ウェル培養物を96ウェルフォーマットで開始し、すぐに通過/フィードを入力することができサイクル。プレートの大部分であるコロニーを、維持するために使用されていない細胞は、他の用途のために採取し、このシステムの製造·コンポーネントを表しています。 メディアの一部または全ては、培養期間後に除去され、廃棄物容器内に堆積されたときに、96ウェル培養性IPSCを給餌することは達成されます。その後、新鮮な培地は、同じプレートに分注します。ロボットは、新しいメディアとの馴化培地をブレンドを含む、完全にカスタマイズ可能な給紙のためのすべてのウェルを分離するための新しいヒントやメディアトラフを使用することができます。 幹細胞の典型的な経過は、しばしば遠心分離ステップの方法を必要とします。ここで説明するプロトコルは、解離を正常化し、遠心分離を排除することを目指しています。ロボットは37°Cの傾斜ランプ上に取り付け、96ウェルプレートに解離試薬を提供するとき通路プロトコルが開始されます。予め設定された時間の後、解離した細胞は、ユーザーが制御を持つ洗浄作用で収集されています位置、繰り返し、ボリューム、およびトリチュレーション速度オーバーL。酵素の時間、トリチュレーション速度と摩砕繰り返し数は解離コロニーの大きさと均一性（ 図2）を変化させるのに十分であったが、各パラメータは、特定の細胞株の要件に合うように調整可能です。この制御は、変化率、位置、および繰り返しでピペット技術者によって導入された変動を除去します。解離細胞を回収し、新鮮な培地とリザーバーにプールされると、それらを新しいプレートに分配されます。基質分解または酵素作用による細胞死から遠心分離し、播種の問題を回避するために、解離試薬は信頼播種をもたらした許容可能な解離の最小点に希釈しました。この技術は、媒体34 mTeSR1中でのタンパク質分解およびコラーゲン分解試薬 ​​のために効果的であった、比較的高いタンパク質含有量を有するだけでなく、低タンパク質培地中で効果的なエッセンシャル·8 35様</SUP>、本システムと互換性があり、どちらも（E8データは示さず）。 通過後の幹細胞の播種密​​度を制御することは日常的で成功した幹細胞培養に最も重要です。低すぎる、または高播種すると、不規則な通路間隔を引き起こすことに加えて、異所性分化および多能性の損失をもたらすことができます。 （6分割1）6ウェルプレートの1ウェル全体新しい6ウェルプレートに播種するために使用される典型的な幹細胞培養は分割比に依存します。液体ハンドリングロボットと、この比は、使用者のニーズに合うように調整することができる（ 例えば 、1：6,1：9、1:12、 等 ）、それが通過間隔に最も影響を与えます。ロボットは、経験的に決定されるべきユーザのニーズに応じて、以下の列一列全体（8ウェル）、または複数の列を収穫することができます。午前1時12分を分割するとき、脂肪および線維芽細胞由来のiPS細胞は、4日目に継代との定期的な3日間の給餌スケジュールを維持しました。この場合、一つの列を収集し、各サイクル（ 図3A）と1:12の分割を作成つの新しい96ウェルプレートに播種するために使用されました。残りの11ウェルは、下流の用途に利用可能でした。これらの11の生産井を採取するために、通路プロトコルは細胞を収集するためのトラフに堆積した以外は同様にしました。あるいは、細胞をプレート上に残すことができ、直接使用します。 ルーチン分割スケジュールをカウントすることなく通過に一貫した播種密度通路を達成し、維持するために、私たちのプロトコルは、コロニーが通過するための理想的な濃度であるときに、同じ列の所定の数を分割するために呼び出します。ユーザーが通過するための適正な濃度を特定するには、一連の画像がハイライト理想的な通路密度（ 図3B）で密度の範囲を示す生成されました。通過するタイミングを決定するために、技術者はそのプレートを調べ、濃度画像スケールと比較します。アイデア通路へリットル濃度は、脂肪および線維芽細胞由来のiPS細胞の培養物から決定され、ほとんどのコロニーとの間の空間は、隣接するコロニーの直径の約25％のときであることが見出されました。これは、コロニーが均一に分布されることが重要です。一つの追加の給餌サイクルが異所性分化のためのトリガーである、コロニー触れることになるため、コロニー分離のこの量は、最大の望ましい濃度に相関します。 ここで開発に必要なプロトコルは、96ウェルフォーマットでの培養を開始する方法と、密度の問題の後に文化をリセットする方法に対処します。新たな培養が開始されると、継代前最良播種密度と給電サイクル数は不明です。播種後に、使用可能な密度を確保するために、ロボットは連続希釈（ 図4A）で96ウェルプレート全体の既存または解凍した細胞を分配します。このような勾配の例の結果は、 図4B-Eに示されています。いくつか投入後サイクルは、いくつかの列は、技術者が定期的に培養を開始するために均一に希釈し、プレートに播種するためにロボットを使用する点で分割するのに理想的な密度に近づきます。この密度勾配プロトコルはまた、不規則なプレートに規則的な通過間隔およびコロニーの均一性を回復するために使用されました。通路が遅れたり、見逃している場合は通路が早すぎる場合は、コロニーの密度が低すぎると、個々のコロニーが均等によく全体に分散されずに大きくなりすぎる場合がある、コロニー密度とサイズは、高くなりすぎます。密度勾配プロトコルは、これらの問題を解決し、ユーザーは、ウェルの理想的播種セットを選ぶことによって再起動することができます。 二つのiPS細胞株は、ロボット文化の3ヶ月後に多能性のままでした。 幹細胞の多能性の維持に悪影響培養条件36,37によって影響され得ます。脂肪および線維芽細胞がiPS細胞株（それぞれ-iPS細胞、F-iPS細胞）pluripを維持由来するかどうかを評価するために、otency、2行は3ヶ月間、上述した後、多能性マーカーを検討したように、ロボットハンドリング液体上で培養したときにロボット長期間96ウェルプレート中で培養しました。この期間の両方の回線を遠心分離することなく、タンパク質分解およびコラーゲン分解解離試薬でより大きい20回継代しました。 SSEA-4は、細胞表面（ 図5A-L）で観察されたのOct4およびNanogについて染色し、iPS細胞およびF-iPS細胞株からの固定96ウェルプレートは、これらのマーカーの核内蓄積を示しました。 41 -これは、多能性IPSC 38のための以前の報告と一致しています。 DAPIで対比すると、三多能性マーカーについて陽性ではなかった追加の細胞を明らかにしませんでした。染色体異常は、一般的に、幹細胞培養42,43の間に観察されるが、 図5A-Lに示すような多能性マーカーの分布に影響を与えないことがあります。 Karyotype分析は、両方のロボット継代iPS細胞株は、ロボットの培養方法は、通常、（ 図5M-N）に発生する可能性があるものを超えて染色体不安定性を導入しなかった示唆、46正常な染色体を持っていた明らかにしました。 確立された幹細胞の遺伝子発現マーカーをロボット培養iPS細胞株における1,41,44,45を調べるために、全RNAを染色し、核型分析と並行して収集しました。両方の96ウェルプレートiPS細胞株は、各ラインから分化した心筋細胞はしなかったのに対し、多能性マーカーNANOG、POU5F1とREX1の類似表現を持っていた、また、（HDFを）（ 図6）は、ヒト皮膚線維芽細胞の別の行をしました。両方の株に由来する心筋細胞がMYL7のHDFのに対し陽性であったと幹細胞がMYL7を発現しなかった。どちらのiPS細胞株は小分子と心筋細胞に分化させた、Wnt経路操作技術は、46最近記載します</sup>。染色された場合には、両方のラインからの心筋細胞はcTnTのは、明確な筋節形成（ 図7）で陽性でした。 96ウェルフォーマットで心筋細胞への分化をウェルの80％以上に成功した（データは示さず）。一緒に、これらのデータは、3ヶ月を示唆しているとロボットカルチャーの20以上の通路が心筋細胞にも分化することが可能であった多能性と一貫性の転写プログラムを示す染色体が正常細胞をもたらしました。 ロボット幹細胞培養装置及び典型的なiPS細胞の培養ルーチンの概要を図1。96ウェル細胞培養幹ための典型的な床配置で示す（A）ロボット液体ハンドリングシステム。新しい滅菌ピペットチップ（先端）、取り外し可能な先端廃棄物容器（廃棄物）、マルチウェル必要液体試薬（液体）を保持するためにオートクレーブトラフは、96ウェルプレートが配置されているAN （ピペットヘッド）左/右に移動し、アップ/ダウンの8チャンネルのロボットピペットヘッドは、温度制御され、傾斜ランプ（96ウェルプレート）上に支持さdを。ラックを保持板蓋（PLHR）。下記表に示すベッド位置番号。摂食と航路：（B）ロボットiPS細胞の培養は、2つの段階があります。コロニー板が通路に準備ができたときにセル生産のサイクルが開始されます。ユーザーは、で通路に所望の比率を選択し、96ウェルプレートのロボットの種の新しいグループが再び通過させるための準備ができるまで、一定の間隔で供給されます。プレートを通過する準備ができたら、各プレートのほとんどは、その後のコロニープレートに播種するために使用されていないため、システムの生産段階を表す、他の用途に利用可能です。凍結または既存の細胞株は、いつでも導入し、フィード/通路サイクルに維持することができる。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。 常に ">：" =キープtogether.withinページFO」e_content 図2のロボット液体処理パラメータはiPS細胞コロニーの解離特性を制御するために使用することができます 。各代表画像は、まだ96ウェル中に懸濁させながら、線維芽細胞由来のiPS細胞は、指示された処理後に解離を示しています。 （一番上の行、 – C）酵素の時間、無トリチュレーション。 96ウェルプレート中で増殖させた線維芽細胞由来のiPS細胞を行い、タンパク質分解およびコラーゲン解離試薬解離なしロボット摩砕の時間を増加させました。 （中段、D – F）粉砕して速度、3分の酵素。細胞は、タンパク質分解およびコラーゲン分解解離試薬処理の3分に暴露し、その後、175μlの増殖培地を適用し、各ウェルを指示された速度で上下回ピペッティングし。 μL/秒=マイクロリットルのPER二。 （一番下の行、G – I）粉砕して繰返し、3分の酵素、160μL/秒。細胞を、3分間、タンパク質分解およびコラーゲン分解解離試薬に曝露した、175μlの増殖培地は、その後160μL/繰り返し示された数のための秒で粉砕し、適用した。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。 図3.一般的な脂肪および線維芽細胞iPS細胞コロニーのメンテナンス方式及び経過に定期的な給紙/通路サイクルを維持するかを決定するためのコロニー密度の一連の画像。（A）通過に準備ができて、脂肪または線維芽細胞を96ウェルiPS細胞コロニーから始めて、セルの1列は、遠心分離することなく、ロボットに継代し、希釈しましたプレートを再び通過する準備ができていたまで、その後は特定の間隔で供給した12の新しい列に。細胞産生のために、コロニーを維持するために使用されていないカラムは、その後の使用のために継代し、収集しました。列の任意の数の膨張率を制御するために継代することができます。通路に、濃度一連の画像をキャプチャ24時間毎にユーザに提供されたときを決定する（B）。トップ赤いボックスで（最初の播種後72時間以内）コロニーは、通路に十分に緻密ではなく、供給されるべきです。密度が（〜96時間で）緑色のボックスに示されていることが一致した場合、コロニーは、通路のための理想的な密度です。 120時間では、コロニーは、通路にすぎ緻密で、このシナリオは避けるべきです。後者は、強くお勧めしますこの密度で播種密度勾配が、ルーチン培養で解決することができます。白バーが200μmに等しい。 大きなversiを表示するには、こちらをクリックしてくださいこの図の上。 図4。96ウェルロボット培養システムは、ユーザーが凍結またはアクティブな細胞株から培養を開始し、播種勾配を実行することができます。（A）は、細胞液を凍結細胞ストックから、または積極的な文化を収穫した後、ユーザーが作成し、配置されていますロボットに。ロボットシステムは、列によって分配密度勾配で96ウェルプレートに沿って最初の細胞溶液を分配するために、連続希釈プロトコルを実行します。 （B – E）Aから12列の4からの細胞密度の例として、密度勾配播種プロトコル48時間後。白い線が225ミクロンに等しい。 これの拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください図。 。図5.多能性は、22（脂肪）または23（線維芽細胞）の通路（〜3ヶ月）のために、96ウェルロボット培養中の脂肪やiPS細胞株由来の線維芽細胞のために維持されている（A – L）脂肪および線維芽細胞由来のiPS細胞の細胞株は、ロボットでしたその後、DAPIの対比で多能性マーカーOct4の、Nanogの、またはSSEA4固定し、染色した22または23継代96ウェルプレート中で遠心分離することなく、本文中に記載されるように供給され、継代しました。白いバーは100ミクロンに等しいです。 （M – N）Aに記載されているものと並行培養物を、46染色体の正常な相補体を明らかにした核型分析のために提出された。 拡大版のOを表示するには、こちらをクリックしてくださいこの図F。 図6.脂肪（96-A）および線維芽細胞（96-F）由来のiPS細胞は、多能性遺伝子の発現を維持し、96ウェルのロボット形式で20以上の継代培養し、心筋細胞に分化した。全mRNAは、両方のロボット培養iPS細胞株から抽出しました心筋細胞は、両方のラインから分化、ならびに、（CM-A =脂肪iPS細胞由来の心筋細胞、CM-F =繊維芽細胞iPS細胞は、14日の分化誘導後に回収し、心筋細胞由来）および多能性マーカーNANOG、POU5F1、REX1を探査するために、RT-PCRに使用します心筋マーカーMYL7とローディングコントロールGAPDH。ヒト皮膚線維芽細胞（HDF）は、収集され、非iPS細胞、非心筋細胞を対照として使用した。 クリックしてくださいここで、この図の拡大版を表示します。 。図7.線維芽細胞と脂肪由来iPS細胞は、96ウェル長期ロボット培養後に心筋細胞に分化する能力を維持して（A – H）脂肪および線維芽細胞性IPSCは、心筋細胞に分化した20以上の継代のために、96ウェルのロボット形式で培養しました。 14日間分化誘導した後、96ウェルプレートに結合した心筋細胞はトロポニンT（赤）、F-アクチン（緑色）および核（青）の免疫染色用ガラススライド上に低密度で解離し、再プレーティングした。 表示するにはこちらをクリックしてくださいこの図の拡大版。 p_upload / 52755 / 52755fig8.jpg "/> 図8. 96ウェルプレート幹細胞培養をスケールアップ。幹細胞の生産のスケールアップは、プレートの後続グループをシードするために使用されるプレートの数に依存します。ユーザは、各分割された機会にプレートの数が同じで継代することにより1つの製造レベルを維持する以上のプレートを播種することによって生産を拡大することができます。例えば、サイクル0において、1枚の96ウェルプレートは、12倍の拡張を作成する、12の新しいプレート（サイクル1）に継代されます。 12プレートの一方は12プレート（2サイクル1）の新しいセットに継代または複数のプレート（3サイクル2）を継代することにより拡張される場合には、この比率を維持することができます。通過中に、コロニーを維持するために使用されていない任意のプレートは、ダウンストリームアプリケーションに使用できます。コロニーのメンテナンスや他の用途のための132のために12：したがって、日常的に12プレートを継代すると、2つの通路のように多くの144のようなプレートが得られる可能性があります。">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。 セル生産のための96ウェルプレートベースの文化の図9の効率が大幅に手動栽培を超えています。図8で述べたように、一方のプレートは、その後、144プレートに継代することができる12のプレートを、シードする継代することができます。膨張のこのレートは、二つの分割の機会で達成することができます。技術者は、彼らは顕微鏡でそれを調べて、ロボットにそれを置くために、1つの96ウェルプレートで約30秒を過ごす一方、1つの6ウェルプレートを養うために約3.5分かかります。技術者が144プレートを搬送している場合はロボットと供給時に手動文化が養うために、専用の8時間を必要とするのに対し、彼らは約1.2時間の処理プレートを過ごすことになります。 Vにはこちらをクリックしてくださいこの図の拡大版をIEW。