Scalabile piastra a 96 pozzetti Based iPSC cultura e di produzione utilizzando un sistema robotico Liquid Handling

Sviluppo di uno stelo robotica piattaforma coltura cellulare piastra base. La domanda di iPSCs è in crescita a causa della loro utilità nello sviluppo di farmaci e nella medicina rigenerativa. Eppure la produzione scalabile si è concentrata sulla coltura in sospensione 32 in attrezzature relativamente complessa che esclude molti ricercatori e diverge da metodi di coltura aderenti stabiliti. Invece di alterare drasticamente targa comprovata staminali basato metodi di coltura cellulare, come il passaggio ad una cultura di sospensione o utilizzando un microcarrier, ci siamo concentrati sulla miniaturizzazione e automatizzando le nostre tecniche di coltura IPSC aderenti esistenti. Il primo obiettivo era di automatizzare l'alimentazione e passaging per normalizzare l'intero processo di coltura. È stato anche richiesto una piattaforma capace di rapida scala con la tecnologia esistente. Per raggiungere questi obiettivi il metodo è stato concepito per le cellule staminali della cultura in un piatto da 96 pozzetti che utilizzano un sistema di gestione dei liquidi automatizzato (Figura 1). Il protocols sviluppati qui con il robot di gestione dei liquidi per l'alimentazione ed il passaggio non richiedono una fase di centrifugazione o monitoraggio continuo da un tecnico. Questi protocolli sono stati sviluppati con due linee di alimentazione libere IPSC; uno derivato da fibroblasti e l'altro da cellule adipose 33. Il sistema di gestione dei liquidi controllato da computer (Figura 1A) è costituito da una lastra piana che si muove anteriore e posteriore. Il letto ha nove, circa 5 x 3,3 pollici recessi numerati con pressione fermagli per accettare piastre di coltura delle cellule normali, i serbatoi di liquidi e altro hardware personalizzato. La testina di pipette sposta da sinistra a destra (perpendicolare al movimento letto), così come su e giù. Insieme con il letto, la testa pipetta può essere programmato per rimuovere o fornire supporto ovunque sul letto dopo aver raccolto le punte delle pipette da un rack ricaricabile. Se necessario, ciascuno dei 96 pozzetti può essere separata per eliminare la contaminazione incrociata. Nella configurazione attuale, 0 a200 ml di supporti possono essere spostati da ogni punta della testa pipetta, ma altre gamme di volume sono possibili in base alle dimensioni punta. Quando passaging cellule staminali in piastre standard, enzimatici o dissociazione chimica in genere richiede incubazione a 37 ° C. I test iniziali confermato dissociazione con proteolitica e collagenolitica reagente di dissociazione o un reagente a base EDTA risultati migliori a 37 ° C di RT sia per il tempo di dissociazione e omogeneità delle dimensioni delle colonie prodotti per i nostri due 96 pozzetti linee IPSC (dati non mostrati). Per automatizzare il processo di scissione e di evitare lo spostamento piastre dentro e fuori di un incubatore, inclinate, rampe di temperatura controllata che accettano e riproducibile posizionare piastre di coltura standard sono state costruite (Figura 1A). Quando le rampe sono stati riscaldati a 37 ° C, un proteolitica e collagenolitica reagente di dissociazione o EDTA dissociazione base delle iPSCs di piastre a 96 pozzetti era paragonabile alle piastre poste a 37 ° C incubatore (dati not mostrato). Le rampe inclinate sono stati anche utilizzati per consentire puntali di raccogliere i contenuti di un intero e (meno di 5 uL volume residuo) raggiungendo il punto più basso nel pozzo, mentre l'aspirazione da una lastra piana lasciato un volume residuo di circa 10-15 microlitri, risultante in perdita di cellule. La rampa inclinata anche permesso ai pozzetti da lavare (triturati) estraendo supporto nella parte superiore del pozzo inclinato e per raccogliere in fondo. Cultura robotica di cellule staminali nel formato piastra a 96 pozzetti; alimentazione e passaging. Cultura iPSCs utilizzando il sistema di gestione dei liquidi robotizzato ha due fasi; passaggio e l'alimentazione. Quando una colonia è pronto per il passaggio, questo viene suddiviso in un predeterminato rapporto per inizializzare una nuova piastra che viene poi alimentata ad intervalli regolari fino a quando non è pronto per il passaggio di nuovo (Figura 1B). Culture congelati o non 96 pozzetti possono essere avviati nel formato a 96 pozzetti e comporre immediatamente il passaggio / alimentazioneciclo. Le cellule che non sono utilizzati per mantenere la colonia, che è la maggioranza di una piastra, sono raccolte per altri usi e rappresentano la componente produzione di questo sistema. Alimentazione 96 pozzetti iPSCs coltura è raggiunto quando alcuni o tutti i media viene rimosso dopo un periodo di coltura e depositato in un serbatoio dei rifiuti. Poi mezzi freschi è frazionare la stessa targa. Il robot può utilizzare nuovi suggerimenti e le depressioni dei media per separare ogni bene per l'alimentazione completamente personalizzabili, tra cui la miscelazione mezzi condizionati con i nuovi media. Tipico passaggio delle cellule staminali richiede un metodo di dissociazione e spesso una fase di centrifugazione. I protocolli descritti qui mira a normalizzare la dissociazione ed eliminare centrifugazione. Il protocollo passaggio inizia quando il robot trasporta reagente di dissociazione per piastre a 96 pozzetti montato su 37 ° C rampe inclinate. Dopo un tempo prestabilito, le cellule dissociate vengono raccolti con una azione di lavaggio in cui l'utente ha Control la posizione, la ripetizione, volume e frequenza triturazione. Enzima tempo, il tasso di triturazione e il numero di ripetizioni triturazione erano sufficienti a variare le dimensioni delle colonie dissociata e omogeneità (Figura 2), ma ogni parametro è regolabile per adattarsi a esigenze di un determinato linee cellulari. Questo controllo rimuove variabilità introdotta da tecnici che pipetta con aliquote diverse, posizioni e ripetizioni. Una volta che le cellule dissociate sono raccolti e raggruppati in un serbatoio con mezzi freschi, sono distribuiti ad una nuova piastra. Per evitare di centrifugazione e semina problemi dal degrado substrato o morte cellulare a causa di enzimi azione, reagente di dissociazione è stato diluito al punto di minimo di dissociazione accettabile che ha provocato semina affidabile. Questa tecnica è efficace per una proteolitica e collagenolitica reagente dissociazione mTeSR1 medio 34, che ha un relativamente alto contenuto proteico, ma anche efficace in mezzi a basso contenuto proteico come Essential-8 35 </sup>, entrambi i quali sono compatibili con questo sistema (dati non mostrati E8). Controllare la densità di semina di cellule staminali dopo il passaggio è fondamentale per coltura di cellule staminali di routine e di successo. Semina troppo basso o alto può causare differenziazione ectopica e perdita di pluripotenza oltre a causare intervalli passaggio irregolari. Coltura di cellule staminali tipica si basa su rapporto di divisione dove un pozzetto di un 6-pozzetti è usato per seminare un intero nuovo 6-pozzetti (1: 6 split). Con la movimentazione del robot liquido questo rapporto può essere regolata secondo le esigenze dell'utente (ad esempio, 1: 6, 1: 9, 1:12, ecc) ed ha più influenza sull'intervallo passaggio. Il robot può raccogliere meno di una colonna, una intera colonna (8 pozzetti), o più di una colonna a seconda delle esigenze dell'utente, che dovrebbero essere determinate empiricamente. Le iPSCs adiposo e fibroblasti derivati ​​mantenuto un regolare programma di tre giorni che si alimenta con il passaggio al quarto giorno in cui dividere 01:12. In questo caso una colonna è stato raccolto ed utilizzato per inizializzare una nuova piastra a 96 pozzetti, creando un 1:12 split con ogni ciclo (Figura 3A). I restanti 11 pozzi sono stati poi disponibili per applicazioni a valle. Per raccogliere questi 11 pozzi di produzione, il protocollo di passaggio è stato ripetuto eccetto le cellule sono state depositate in un trogolo di raccolta. In alternativa, le cellule possono essere lasciati sulla piastra e usati direttamente. Per raggiungere passaggio densità di semina coerente passaggio senza contare, e mantenere un programma splitting di routine I protocolli richiedono suddividere lo stesso numero predeterminato di colonne quando la colonia è ad una densità ideale per passaggio. Per aiutare gli utenti a identificare la densità corretta per il passaggio, una serie di immagini è stata generata mostra una gamma di densità con una densità ideale passaggio evidenziata (Figura 3B). Per determinare quando passaggio, un tecnico esamina la piastra e lo confronta con la scala dell'immagine densità. L'ideaDensità l per il passaggio è stato determinato dalla cultura dei iPSCs adipose e fibroblasti derivati ​​ed è risultato essere quando lo spazio tra la maggior parte delle colonie era di circa il 25% del diametro colonia adiacente. È importante che le colonie distribuire omogeneamente. Questa quantità di separazione colonia correlato con la densità massima desiderabile perché un ciclo di alimentazione supplementare provocherebbe colonie toccano, che è un trigger per differenziazione ectopica. Un protocollo necessario sviluppato qui indirizza come avviare una cultura nel formato a 96 pozzetti e come reimpostare una cultura dopo un problema di densità. Quando si avvia una nuova cultura, la migliore densità di semina e il numero di cicli di alimentazione prima passaging sono sconosciuti. Per garantire una densità utile dopo la semina, il robot distribuisce cellule esistenti o decongelati attraverso una piastra a 96 pozzetti in una diluizione seriale (Figura 4A). Risultati dell'esempio di tale gradiente sono mostrati nella Figura 4B-E. Dopo diversi alimentazionecicli, alcune colonne avvicinano la densità ideale per dividere, a quel punto un tecnico utilizza il robot per seminare una piastra uniformemente diluito per avviare la cultura regolare. Questo protocollo gradiente di densità è stato anche utilizzato per ripristinare intervalli regolari e di passaggio colonia omogeneità a un piatto irregolare. Se il passaggio è in ritardo o perdere, la densità delle colonie e le dimensioni diventano troppo alti, mentre se il passaggio è troppo presto, la densità colonia è troppo basso e singole colonie può diventare troppo grande, senza essere uniformemente distribuiti in tutto il bene. Il protocollo gradiente di densità di risolvere questi problemi e permette all'utente di riavviare con la scelta di un set ideale seminato di pozzi. Due linee IPSC rimasti pluripotenti dopo 3 mesi di coltura robotica. Manutenzione della pluripotenza delle cellule staminali può essere influenzato negativamente da condizioni di coltura 36,37. Per valutare se adiposo e fibroblasti derivati ​​linee IPSC (a-IPSC, f-IPSC, rispettivamente) mantenuto pluripotency quando coltivate robotizzato in piastre da 96 pozzetti per un periodo di tempo prolungato, le due linee sono state coltivate sul robot manipolatore come descritto sopra per 3 mesi e poi marcatori pluripotenza stati esaminati liquido. Per questo periodo entrambe le linee sono stati diversi passaggi con un reagente di dissociazione proteolitica e collagenolitica maggiore di 20 volte senza centrifugazione. Piastre a 96 pozzetti fissi da un-IPSC e linee f-IPSC colorate per Oct4 e Nanog esposti nucleare accumulazione di questi marcatori, mentre è stata osservata SSEA-4 sulla superficie cellulare (Figura 5A-L). Ciò è coerente con le precedenti relazioni per iPSCs pluripotenti 38-41. Controcolorazione con DAPI non ha evidenziato celle aggiuntive che non erano anche positivo per i tre marcatori pluripotenza. Anomalie cromosomiche sono comunemente osservati durante coltura di cellule staminali 42,43, ma non possono influenzare la distribuzione di marcatori pluripotenza come quelle mostrate in Figura 5A-L. Kanalisi aryotype rivelato entrambe le linee IPSC robot diversi passaggi avevano 46 cromosomi normali, suggerendo il metodo cultura robot non ha introdotto instabilità cromosomica al di là di ciò che potrebbe accadere normalmente (Figura 5 M-N). Per sondare l'espressione genica di cellule staminali stabilito marcatori 1,41,44,45 nelle linee IPSC robotizzato coltivate, l'RNA totale è stato raccolto in parallelo per la colorazione e l'analisi del cariotipo. Entrambe le piastre a 96 pozzetti linee IPSC avevano simile espressione di marcatori pluripotenza Nanog, POU5F1 e REX1 mentre cardiomiociti differenziati da ogni riga no, e neppure una riga separata di fibroblasti dermici umani (HDFs) (Figura 6). I cardiomiociti derivati ​​da entrambe le linee erano MYL7 positivi mentre i HDFs e cellule staminali non hanno espresso MYL7. Entrambe le linee IPSC sono stati differenziati in cardiomiociti con la piccola molecola, Wnt tecnica di manipolazione percorso descritto recentemente 46 </sup>. Quando macchiato, cardiomiociti da entrambe le linee erano cTnT positiva con la formazione sarcomero chiaro (Figura 7). Differenziazione in cardiomiociti nel formato a 96 pozzetti avuto successo in più del 80% dei pozzetti (dati non mostrati). Insieme, questi dati suggeriscono 3 mesi e più di 20 brani di cultura robotica portato nelle cellule cromosomicamente normali che presentano un programma di trascrizione coerente con pluripotenza che erano anche in grado di differenziazione in cardiomiociti. Figura 1. Panoramica della robotica apparecchiature coltura di cellule staminali e tipico della cultura di routine IPSC. (A) sistema di gestione dei liquidi Robotic mostrato con il layout tipico letto per 96 pozzetti staminali coltura cellulare. Nuove punte sterili pipetta (Tips), contenitore di rifiuti punta estraibile (rifiuti), multi-canale e autoclave per tenere richiesti reagenti liquidi (liquidi), piastre da 96 pozzetti sono posizionati un d supportato su una temperatura controllata, rampa inclinata (piastre a 96 pozzetti), 8 canali capo pipetta robotico che si muove a sinistra / destra e su / giù (Dispensare testa). Piatto coperchio tiene rack (PLHR). Numeri di posizione letto indicati nella seguente tabella. La cultura (B) Robotic IPSC ha due fasi: Alimentazione e Passage. Il ciclo di produzione cellulare inizia quando un piatto colonia è pronto per il passaggio. L'utente sceglie il rapporto desiderato di passaggio in corrispondenza ei semi robot un nuovo gruppo di piastre a 96 pozzetti quindi alimentata ad intervalli regolari fino pronti per il passaggio di nuovo. Quando le piastre sono pronti per il passaggio, la maggior parte di ciascuna piastra non viene utilizzato per inizializzare piastre colonia successive ed è disponibile per altri usi, rappresentando così la fase di produzione del sistema. Linee di cellule congelate o esistenti possono essere introdotti in qualsiasi momento e mantenuti nel ciclo di alimentazione / passaggio. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. e_content "fo: keep-together.within-page =" always "> Figura 2. Parametri di gestione liquidi robotizzato può essere utilizzato per controllare IPSC caratteristiche colonia dissociazione. Ogni immagine rappresentativa mostra fibroblasti derivati ​​iPSCs dissociate dopo il trattamento indicato mentre ancora sospesi in 96 pozzetti. (Riga superiore, A – C) Enzima Tempo, senza triturazione. Fibroblasti iPSCs derivati ​​coltivate in piastre a 96 pozzetti sono stati sottoposti a tempi di proteolitica e collagenolitica dissociazione reagente dissociazione e senza triturazione robotico aumentando stata eseguita. (Middle Row, D – F) Tasso di triturazione, tre minuti enzima. Le cellule sono state esposte a tre minuti di proteolitici e trattamento del reagente di dissociazione collagenolitica e poi è stato applicato mezzi di crescita 175 ml e ogni pozzetto pipettati su e giù una volta alla velocità indicata. pl / sec = microlitri per secondo. (Fila in basso, G – I) Trituration Ripetizioni, 3 minuti enzima, 160 ml / sec. Le cellule sono state esposte a proteolitici e collagenolitica reagente di dissociazione per 3 minuti, 175 mezzi di crescita microlitri è stato applicato, poi triturato a 160 ml / sec per il numero di ripetizioni indicato. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 3. adiposo tipico schema manutenzione colonia fibroblasti IPSC e una serie di immagini di densità colonia per determinare quando il passaggio a mantenere un regolare ciclo di alimentazione / passaggio. (A) A partire da un adiposo o fibroblasti 96 pozzetti iPSC colonia pronto per il passaggio, una colonna di celle è stato diversi passaggi sul robot senza centrifugazione e diluitoa 12 nuove colonne che sono stati alimentati a intervalli specifici in seguito fino a quando il piatto era pronto a passo di nuovo. Per la produzione di celle, le colonne non utilizzati per mantenere la colonia sono stati diversi passaggi e raccolti per il successivo utilizzo. Qualsiasi numero di colonne possono essere diversi passaggi per controllare la frequenza di espansione. (B) per determinare quando il passaggio, una serie di immagini di densità catturate ogni 24 ore è stato fornito agli utenti. Nella scatola rossa superiore (entro 72 ore dopo la semina iniziale) della colonia non è abbastanza denso di passaggio e deve essere alimentato. Quando la densità corrisponde a quello mostrato nella casella verde (a ~ 96 ore), la colonia è ad una densità ideale per passaggio. Con 120 hr, la colonia è troppo densa per passaggio e questo scenario dovrebbe essere evitato. Questi ultimi possono essere risolti con un gradiente di densità di semina, ma la cultura di routine in questa densità è fortemente sconsigliato. Bar Bianco è uguale a 200 micron. Clicca qui per vedere un più ampio versisu questa figura. Figura 4. 96 pozzetti sistema di coltura robotica consente agli utenti di iniziare colture da linee cellulari congelati o attivi ed eseguire un gradiente di semina. (A) Una soluzione cella viene preparata dall'utente da una cella stock congelate o dopo la raccolta una cultura attiva e collocato sul robot. Il sistema robot esegue quindi un protocollo di diluizione seriale di distribuire la soluzione cellula iniziale lungo la piastra a 96 pozzetti con gradiente di densità distribuita per colonna. (B – E) Esempi di densità cellulare da quattro delle dodici colonne da A, 48 ore dopo la semina protocollo gradiente di densità. Linee bianche uguale 225 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questofigura. Figura 5. pluripotenza viene mantenuta per adiposo e fibroblasti derivate linee IPSC durante 96 pozzetti cultura robotica per il 22 (adiposo) o 23 (fibroblasti) passaggi (~ 3 mesi). (A – L) adiposo e fibroblasti derivate linee cellulari IPSC erano robot nutriti e diversi passaggi come descritto nel testo senza centrifugazione in piastre a 96 pozzetti per 22 o 23 passaggi poi fissate e colorate per i marcatori pluripotenza Oct4, Nanog, o Ssea4 con DAPI di contrasto. Bar Bianco è uguale a 100 micron. (M – N). Culture parallele a quelle descritte in A sono state presentate per l'analisi del cariotipo che ha rivelato una normale dotazione di 46 cromosomi Cliccate qui per vedere una versione più grande of questa cifra. Figura 6. adiposo (96-A) e fibroblasti (96-F) derivato iPSCs coltivati ​​da più di 20 passaggi nel formato da 96 pozzetti robotica mantenuto l'espressione genica pluripotenza e differenziati in cardiomiociti. Totale mRNA è stato estratto da entrambe le linee IPSC robot coltivate così come cardiomiociti differenziati da entrambe le linee (CM-A = adipose cardiomiociti iPSC derivati, CM-F = fibroblasti iPSC derivato cardiomiociti, raccolto 14 giorni dopo l'induzione differenziazione) e utilizzata per RT-PCR per sondare marcatori pluripotenza Nanog, POU5F1, REX1, cardiomiociti marcatore MYL7 e controllo carico GAPDH. Fibroblasti dermici umani (HDF) sono stati raccolti e utilizzati come un non-IPSC, controllo non cardiomiociti. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 7. fibroblasti e adiposo derivato iPSCs mantenuto la capacità di differenziarsi in cardiomiociti dopo lungo termine a 96 pozzetti cultura robotica (A – H). Adiposo e iPSCs fibroblasti coltivati ​​nel formato a 96 pozzetti robotica per più di 20 passaggi sono stati differenziati in cardiomiociti . 14 giorni dopo l'induzione di differenziazione, piatto legato cardiomiociti 96 pozzetti erano dissociate e ripiastrate a bassa densità su vetrini per immunocolorazione di troponina T (rosso), F-actina (verde) e nuclei (blu). Cliccate qui per visualizzare un versione più grande di questa figura. p_upload / 52755 / 52755fig8.jpg "/> Figura 8. Scaling up piastra di coltura di cellule staminali da 96 pozzetti. Scale up della produzione di cellule staminali dipende dal numero di lastre utilizzate per seminare il successivo gruppo di lastre. L'utente può mantenere un livello di produzione dal passaging lo stesso numero di piastre a ogni occasione frazionamento o espandere la produzione mediante inseminazione di più piastre. Ad esempio, nel ciclo 0, una piastra a 96 pozzetti è diversi passaggi a dodici nuove piastre (ciclo 1), creando una espansione 12 volte. Tale percentuale può essere mantenuta se uno dei dodici piatti diversi passaggi è di una nuova serie di dodici piatti (Cycle 1-2) e ampliato da passaging placche multiple (Cycle 2-3). Durante il passaggio, eventuali piastre non utilizzati per mantenere la colonia sono disponibili per applicazioni a valle. Pertanto, passaging 12 piatti routine potrebbe produrre fino a 144 lastre in due passaggi: 12 per la manutenzione delle colonie e 132 per altri usi."> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 9. Efficienza del 96 pozzetti cultura basata piastra per la produzione di celle supera di gran lunga la coltivazione manuale. Come indicato in figura 8, un piatto può essere diversi passaggi per seminare dodici piatti, che possono poi essere diversi passaggi a 144 piatti. Questo tasso di espansione può essere raggiunto in due occasioni di divisione. Un tecnico richiede circa 3,5 minuti per alimentare una piastra da 6 pozzetti che spendono circa 30 secondi con una piastra a 96 pozzetti per esaminare sul microscopio e posizionarlo sul robot. Se il tecnico sta portando 144 piastre, che spenderanno circa 1,2 piastre di gestione hr durante l'alimentazione con il robot considerando che la cultura manuale richiederà un 8 ore dedicato a nutrire. Cliccate qui per view una versione più grande di questa figura.