Scalable plaque de 96 puits Basé iPSC Culture et production en utilisant un système robotique Liquid Handling

Le développement d'une plaque à base de plate-forme robotique tige de culture cellulaire. La demande pour les CSPi se développe en raison de leur utilité dans le développement de médicaments et la médecine régénérative. Pourtant, la production évolutive a mis l'accent sur ​​la culture de suspension 32 dans un équipement relativement complexe qui exclut de nombreux chercheurs et diverge à partir de méthodes de culture adhérentes établies. Plutôt que de modifier radicalement plaques éprouvée souches basée méthodes de culture de cellules, telles que le passage à une culture en suspension ou en utilisant un microsupport, nous nous sommes concentrés sur la miniaturisation et l'automatisation de nos techniques existantes de culture iPSC adhérentes. Le premier objectif était d'automatiser l'alimentation et de repiquage de normaliser le processus de culture entière. Une plate-forme capable d'élargissement rapide avec la technologie existante était également nécessaire. Pour atteindre ces objectifs une méthode a été conçue pour des cellules souches de la culture dans une plaque de 96 puits en utilisant un système de manipulation de liquides automatisé (Figure 1). Le protPROTOCOLES développés ici avec le robot de manipulation de liquides pour l'alimentation et le passage ne nécessitent pas une étape de centrifugation ou une surveillance continue par un technicien. Ces protocoles ont été élaborés avec deux lignes iPSC gratuits desserte; une dérivée de fibroblastes et l'autre de 33 cellules adipeuses. Le système de manipulation de liquide commandé par ordinateur (figure 1A) est constitué d'un plateau qui se déplace avant et arrière. Le lit a neuf, environ cavités numérotées 5 x 3,3 pouces avec une pression clips de fixation pour accepter des plaques de culture cellulaire standard, réservoirs de liquide et autres matériel personnalisé. Les pipettes tête se déplace de gauche à droite (perpendiculaire au mouvement de lit) ainsi que de haut en bas. Ensemble, avec le lit, la tête de pipette peut être programmé pour supprimer ou fournir des médias partout sur le lit après avoir ramassé des embouts de pipette à partir d'un support rechargeable. Le cas échéant, chacun des 96 puits peuvent être séparés afin d'éliminer une contamination croisée. Dans la configuration actuelle, 0 à200 pi de médias peuvent être déplacés par chaque extrémité de la tête de la pipette, mais d'autres gammes de volumes sont possibles selon la taille de la pointe. Lorsque passage de cellules souches dans des plaques standard, enzymatique ou chimique dissociation nécessite généralement incubation à 37 ° C. Test initial confirmé dissociation avec un protéolytique et collagénolytique réactif de dissociation ou d'un réactif à base de EDTA mieux performé à 37 ° C à RT à la fois pour le temps de dissociation et l'homogénéité de la taille des colonies produite pour nos deux 96 puits lignes iPSC (données non présentées). Pour automatiser le processus de scission et d'éviter le déplacement des plaques dans et hors d'un incubateur, des rampes inclinées, à température contrôlée qui acceptent et positionner de manière reproductible plaques standard de culture ont été construits (figure 1A). Lorsque les rampes ont été chauffés à 37 ° C, une protéolytique et collagénolytique réactif de dissociation ou de l'EDTA dissociation des iPSCs de plaques à 96 puits sur la base était comparable aux plaques placées dans un incubateur à 37 ° C (données not représenté). Les rampes en pente ont également été utilisés pour permettre aux embouts de pipette pour recueillir le contenu d'un ensemble de puits (moins de 5 pi de volume résiduel) en atteignant le point dans le puits alors que l'aspiration la plus basse d'une plaque plane laissé un volume résiduel d'environ 10-15 pi, résultant une perte de cellule. La rampe en pente a également permis aux puits pour être lavés (triturés) en éjectant les médias au sommet du puits incliné et recueillir au fond. Robot culture de cellules souches dans le format de plaque à 96 puits; et des passages d'alimentation. Culture de iPSCs l'aide du système de manipulation de liquide robotisé comporte deux phases; passage et l'alimentation. Quand une colonie est prêt à passage, elle est divisée en un rapport prédéterminé pour ensemencer une nouvelle plaque qui est ensuite amené à intervalles réguliers jusqu'à ce qu'il soit à nouveau prêt à passage (figure 1B). Les cultures congelées ou non de 96 puits peuvent être démarrés dans le format de 96 puits et entrez immédiatement le passage / alimentationcycle. Les cellules qui ne sont pas utilisés pour maintenir la colonie, qui est la majorité d'une plaque, sont récoltées pour d'autres usages et représentent le composant de production de ce système. Nourrir 96 puits CSPi culture est accomplie lorsque tout ou partie des médias est enlevé après une période de culture et déposé dans un réservoir de déchets. Puis milieu frais est aliquoté à la même plaque. Le robot peut utiliser de nouvelles astuces et les creux des médias pour séparer chaque puits pour l'alimentation entièrement personnalisable, y compris le mélange des milieux conditionnés avec les nouveaux médias. Passage typique des cellules souches nécessite un procédé de dissociation et souvent une étape de centrifugation. Les protocoles décrits ici vise à normaliser la dissociation et d'éliminer centrifugation. Le protocole de passage commence lorsque le robot fournit réactif de dissociation de plaques à 96 puits monté sur 37 ° C rampes inclinées. Après un temps prédéterminé, les cellules dissociées sont collectées avec une action de lavage où l'utilisateur a control sur la position, la répétition, le volume et le taux de trituration. Enzyme temps, le taux de trituration et le nombre de répétitions de trituration étaient suffisantes pour faire varier la taille de la colonie dissociée et l'homogénéité (Figure 2), mais chaque paramètre est réglable pour répondre aux exigences d'une cellule donnée ligne. Cette commande supprime la variabilité introduite par des techniciens qui pipette avec des taux variables, les positions et les répétitions. Une fois que les cellules dissociées sont collectées et rassemblées dans un réservoir avec du milieu frais, ils sont distribués dans une nouvelle plaque. Pour éviter de centrifugation et de semis problèmes de dégradation du substrat ou la mort cellulaire due à l'action de l'enzyme, réactif de dissociation a été dilué au point minimale de dissociation acceptable qui a abouti à l'ensemencement fiable. Cette technique est efficace pour une protéolytique et collagénolytique réactif de dissociation dans un milieu mTeSR1 34, qui a une teneur relativement élevée en protéines, mais également efficace dans des milieux protéiques faibles comme Essential-8 35 </sup>, qui sont tous deux compatibles avec ce système (E8 données non présentées). Le contrôle de la densité d'ensemencement des cellules souches après le passage est primordiale pour la culture de cellules souches routine et réussie. Ensemencement trop faible ou élevé peut entraîner dans la différenciation extra-utérine et la perte de la pluripotence en plus de causer des intervalles de passage irréguliers. La culture de cellules souches typique repose sur le ratio fractionnement où un puits d'une plaque à 6 puits est utilisée pour ensemencer une toute nouvelle plaque de 6 puits (un 1: split 6). Avec le robot de manipulation de liquide, ce rapport peut être ajusté en fonction des besoins de l'utilisateur (par exemple, 1: 6, 1: 9, 1:12, etc.) et il a le plus d'influence sur l'intervalle de passage. Le robot peut récolter moins une colonne, une colonne entière (8 puits), ou plus d'une colonne en fonction des besoins de l'utilisateur, qui doivent être déterminées de manière empirique. Les CSPi adipeux et fibroblastes dérivés a maintenu un programme d'alimentation de trois jours régulier avec passage sur le quatrième jour quand diviser 01h12. Dans ce cas, une colonne a été récolté et utilisé pour ensemencer une nouvelle plaque de 96 puits, créant une scission 01:12 à chaque cycle (figure 3A). Les 11 puits restants étaient alors disponibles pour les applications en aval. Pour récolter les 11 puits de production, le protocole de passage a été répété, sauf les cellules ont été déposées dans une auge de collecte. En variante, les cellules peuvent être laissées sur la plaque et utilisées directement. Pour atteindre cohérente densité d'ensemencement un passage à l'sans compter, et de maintenir un calendrier de fractionnement de routine, nos protocoles appellent pour diviser le même nombre prédéterminé de colonnes quand la colonie est à une densité idéal pour le passage. Pour aider les utilisateurs à identifier la bonne densité pour le passage, une série d'images a été généré montrant une gamme de densités, avec une densité de passage idéal mis en évidence (figure 3B). Pour déterminer quand au passage, un technicien examine leur assiette et la compare à l'échelle de l'image de densité. L'idéel densité de passage est déterminée à partir de la culture des iPSCs adipeux et fibroblastes dérivée et jugée lorsque l'espace entre la plupart des colonies était d'environ 25% du diamètre de la colonie adjacente. Il est important que les colonies soient distribués de façon homogène. Cette quantité de séparation de la colonie est en corrélation avec la densité maximale souhaitable en raison d'un cycle d'alimentation supplémentaire se traduirait par des colonies de toucher, qui est un déclencheur de différenciation ectopique. Un protocole nécessaire développé ici traite de la façon de démarrer une culture dans le format de 96 puits et la façon de réinitialiser une culture après un problème de densité. Quand une nouvelle culture est démarré, la meilleure densité de semis et le nombre de cycles d'alimentation avant repiquage sont inconnus. Pour assurer une densité utilisables après le semis, le robot distribue des cellules existantes ou décongelés à travers une plaque de 96 puits dans une dilution en série (figure 4A). Exemple résultats d'un tel gradient sont représentés sur la figure 4B-E. Après plusieurs alimentationcycles, certaines colonnes approchent la densité idéale pour diviser, à quel point un technicien utilise le robot pour ensemencer une plaque uniformément dilué pour commencer la culture régulière. Ce protocole de gradient de densité a également été utilisé pour restaurer des intervalles de passage réguliers et colonie homogénéité à une plaque irrégulière. Si le passage est retardé ou manqué, la densité et la taille de la colonie devient trop élevé, alors que si le passage est trop tôt, la densité de la colonie est trop faible et des colonies individuelles peut devenir trop volumineux sans être distribuée uniformément à travers le puits. Le protocole de gradient de densité résout ces problèmes et permet à l'utilisateur de redémarrer en sélectionnant un ensemble idéalement ensemencée de puits. Deux lignes iPSC restés pluripotentes après 3 mois de culture robotique. Maintien de la pluripotence des cellules souches peut être affectée par des conditions de culture 36,37. Pour évaluer si adipeux et fibroblastes dérivés lignes iPSC (un iPSC, f-iPSC, respectivement) maintenu pluripotency lorsqu'elles sont cultivées de manière robotisée dans des plaques à 96 puits pendant une période prolongée de temps, les deux lignes ont été cultivées sur le robot de manipulation tels que décrits ci-dessus pendant 3 mois, puis les marqueurs de pluripotence liquide ont été examinés. Pour cette période, les deux lignes ont été passées avec un réactif de dissociation protéolytique et collagénolytique de plus de 20 fois sans centrifugation. Plaques à 96 puits fixe à partir d'une des lignes et iPSC-f-iPSC colorées pour Oct4 et Nanog exposées accumulation nucléaire de ces marqueurs tandis que SSEA-4 a été observée sur la surface des cellules (Figure 5A-G). Ceci est cohérent avec les rapports précédents pour CSPi pluripotentes 38-41. Contre-coloration avec du DAPI n'a pas révélé d'autres cellules qui ne sont pas aussi positifs pour les trois marqueurs de la pluripotence. Les anomalies chromosomiques sont couramment observées au cours de la culture de cellules souches 42,43 mais peuvent ne pas affecter la distribution des marqueurs de la pluripotence comme ceux montrés sur la figure 5A-L. Kanalyse de aryotype révélé deux lignes iPSC robotisée passages avaient 46 chromosomes normaux, suggérant la méthode de culture robotique n'a pas introduit une instabilité chromosomique delà de ce qui pourrait se produire normalement (Figure 5M-N). Pour sonder tige expression des gènes marqueurs des cellules 1,41,44,45 établi dans les lignes iPSC robot en culture, l'ARN total a été recueilli en parallèle à la coloration et analyse du caryotype. Les deux plaques à 96 puits lignes iPSC avaient expression similaire de marqueurs de pluripotence NANOG, POU5F1 et REX1 alors cardiomyocytes différenciés de chaque ligne ne l'ont pas, ni ne une ligne distincte des fibroblastes dermiques humains (HDFS) (figure 6). Les cardiomyocytes dérivés des deux lignes étaient MYL7 positif alors que les HDFS et les cellules souches ne exprimaient MYL7. Les deux lignes iPSC ont été différenciées en cardiomyocytes avec la petite molécule, Wnt technique de manipulation de la voie récemment décrit 46 </sup>. Après coloration, les cardiomyocytes des deux lignes étaient cTnT positive avec la formation de sarcomère claire (Figure 7). La différenciation en cardiomyocytes dans le format à 96 puits a réussi à plus de 80% des puits (données non présentées). Ensemble, ces données suggèrent 3 mois et plus de 20 passages de culture robotique ont donné lieu à des cellules normales dans le chromosome présentant un programme de transcription conforme à la pluripotence qui étaient également capables de différenciation en cardiomyocytes. Figure 1. Présentation de l'appareil de culture de cellules souches robotique et typique de routine de la culture iPSC. (A) Robotic système de manutention de liquides montré avec la disposition de lit typique pour 96 puits endiguer la culture cellulaire. Réactifs liquides nouveaux embouts stériles de pipette (TIPS), conteneur à déchets amovible pointe (de déchets), multi-puits creux autoclavable à tenir nécessaires (liquides), des plaques à 96 puits sont positionnés un d supporté sur une température contrôlée, rampe inclinée (des plaques à 96 puits), 8 canaux tête de pipette robotisée qui se déplace à gauche / droite et haut / bas (tête Pipet). maintien de couvercle rack Plate (PLHR). numéros de position de Bed-dessous dans le tableau. La culture (B) Robotic iPSC comporte deux phases: Alimentation et Passage. Le cycle de production de la cellule commence au moment où une plaque de colonie est prêt à passage. L'utilisateur choisit le rapport souhaité au passage au et les graines de robots un nouveau groupe de plaques à 96 puits, puis nourris à des intervalles réguliers jusqu'à ce que prêt pour le passage à nouveau. Lorsque les plaques sont prêtes à passage, la plupart de chaque plaque est pas utilisé pour ensemencer des plaques de colonies ultérieures et est disponible pour d'autres utilisations, ce qui représente la phase du système de production. Lignées de cellules congelées ou existants peuvent être introduites à tout moment et maintenus dans le cycle charge / passage. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. e_content "fo: keep-together.within-page =" always "> Figure 2. Des paramètres de manipulation des liquides robotique peut être utilisé pour contrôler les caractéristiques iPSC colonie de dissociation. Chaque image représentant montre fibroblastes provenant CSPi dissociées après le traitement indiqué tout en suspension dans le 96 puits. (Rangée du haut, A – C) Enzyme Temps, aucune trituration. IPSCs fibroblastes dérivés cultivées dans des plaques à 96 puits ont été soumis à une période de protéolytique et collagénolytique réactif de dissociation de dissociation et aucune augmentation de trituration robotique a été effectuée. (Rangée du milieu, D – F) Taux de trituration, 3 minutes enzyme. Les cellules ont été exposées à trois minutes de traitement protéolytique et collagénolytique de réactif de dissociation et des milieux de croissance de 175 ul a été appliqué à la pipette dans chaque puits et vers le haut et vers le bas une fois, au taux indiqué. pl / sec = p microlitreser seconde. (Rangée du bas, G – I) trituration répétitions, 3 minutes enzyme, 160 pi / sec. Les cellules ont été exposées à protéolytique et collagénolytique réactif de dissociation pendant 3 minutes, 175 milieux de croissance ul a été appliqué, puis trituré à 160 pi / sec pour le nombre de répétitions indiqué. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 3. adipeux typique et fibroblastes iPSC programme d'entretien de la colonie et une série d'images de densité de la colonie afin de déterminer le moment de passage de maintenir un cycle régulier d'alimentation / passage. (A) Commençant par un tissu adipeux ou fibroblastes 96 puits colonie iPSC prêt à passage, une colonne de cellules a été passé sur le robot sans centrifugation et on le dilue12 nouvelles colonnes qui ont été nourris à des intervalles spécifiques par la suite jusqu'à la plaque était prêt à nouveau passage. Pour la production de la cellule, les colonnes non utilisées pour maintenir la colonie ont été recueillies et soumises à des passages pour une utilisation ultérieure. Tout nombre de colonnes peut être repiqué pour contrôler le taux d'expansion. (B) pour déterminer quand passage, une série d'images de densité capturé toutes les 24 heures a été fournie aux utilisateurs. Dans la zone rouge en haut (dans les 72 heures après l'ensemencement initial) la colonie est pas assez dense pour passage et doit être nourri. Lorsque la densité correspond à celle affichée dans la zone verte (à ~ 96 h), la colonie est à une densité idéal pour le passage. En 120 heures, la colonie est trop dense pour ce scénario passage et doit être évitée. Ce dernier peut être résolu avec un gradient de densité de semis, mais la culture de routine à cette densité est fortement déconseillée. Barre blanche est égale à 200 uM. S'il vous plaît cliquer ici pour voir un plus grand versisur ce chiffre. Figure 4. 96 puits système de culture robotique permet aux utilisateurs de démarrer les cultures de lignées de cellules congelées ou actives et effectuent un gradient d'ensemencement. (A) Une solution de cellules est préparé par l'utilisateur à partir d'un stock de cellules congelées ou après la récolte d'une culture active et placé sur le robot. Le système robotisé effectue ensuite un protocole de dilution en série à distribuer la solution initiale de cellules le long de la plaque de 96 puits avec le gradient de densité distribué par colonne. (B – E) Exemples de la densité des cellules à partir de quatre des douze colonnes de A, 48 h après le protocole d'ensemencement à gradient de densité. Des lignes blanches égalent 225 um. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cettefigure. Figure 5. pluripotence est maintenue pendant adipeux et fibroblastes dérivée lignes iPSC pendant 96 puits pour culture de robot 22 (adipeux) ou 23 (fibroblastes) passages (~ 3 mois). (A – L) adipeuse et iPSC fibroblastes provenant des lignées cellulaires ont été robotique nourris et des passages comme décrit dans le texte sans centrifugation dans des plaques à 96 puits pendant 22 ou 23 passages puis fixées et colorées pour les marqueurs de pluripotence Oct4, Nanog, ou SSEA4 avec colorant DAPI. Barre blanche est égale à 100 um. (M – N). Cultures parallèles à celles décrites dans A ont été soumis à l'analyse du caryotype qui a révélé un complément normal de 46 chromosomes S'il vous plaît cliquez ici pour afficher une version plus grande of ce chiffre. Figure 6. adipeux (96-A) et de fibroblastes (96-F) dérivé CSPi cultivées depuis plus de 20 passages dans le format de 96 puits robotique maintenu l'expression du gène de la pluripotence et différenciées en cardiomyocytes. ARNm total a été extrait de deux lignes iPSC robotisée culture ainsi que des cardiomyocytes différenciés des deux lignes (CM-A = adipeux cardiomyocytes iPSC dérivés, CM-F = fibroblastes iPSC dérivé cardiomyocytes, recueilli 14 jours après induction de la différenciation) et utilisé pour la RT-PCR pour sonder des marqueurs de la pluripotence NANOG, POU5F1, REX1, cardiomyocytes marqueur MYL7 et de contrôle de chargement GAPDH. Fibroblastes dermiques humains (HDF) ont également été collectées et utilisées en tant que non-iPSC, le contrôle non-cardiomyocytes. S'il vous plaît cliquer sur ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 7. fibroblastes et adipeux dérivé CSPi ont maintenu la capacité de se différencier en cardiomyocytes après long terme de 96 puits culture robotique (A – H). Adipeux et CSPi de fibroblastes cultivés dans le format de 96 puits robotique pour plus de 20 passages ont été différenciées en cardiomyocytes . 14 jours après induction de la différenciation, plaques lié cardiomyocytes 96 puits ont été dissociés et réétalées à une faible densité sur des lames de verre pour un marquage de la troponine T (rouge), la F-actine (vert) et noyaux (bleu). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre. p_upload / 52755 / 52755fig8.jpg "/> Figure 8. Mettre en place la culture de cellules souches plaque de 96 puits. Échelle de la production de cellules souches dépend du nombre de plaques utilisées pour ensemencer le groupe suivant de plaques. L'utilisateur peut soit maintenir un niveau de production par passage le même nombre de plaques à chaque occasion scission ou d'accroître la production par ensemencement plusieurs plaques. Par exemple, dans le cycle 0, une plaque de 96 puits est des passages à douze nouvelles plaques (cycle 1), la création d'une expansion pli 12. Ce taux peut être maintenu que si l'un des douze plaques est un passage à une nouvelle série de douze plaques (Cycle 1 à 2) ou élargi par passage de plusieurs plaques (cycle 2 à 3). Au cours de passage, toutes les plaques ne sont pas utilisées pour maintenir la colonie sont disponibles pour les applications en aval. Par conséquent, les plaques 12 de façon routinière repiquage peut donner jusqu'à 144 plaques en deux passages 12 pour l'entretien de la colonie et 132 à d'autres fins."> S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 9. Efficacité de la culture basée plaque de 96 puits pour la production de cellules dépasse largement la culture manuelle. Comme indiqué dans la figure 8, une plaque peut être repiqué d'ensemencer douze plaques, qui peuvent ensuite être passées à 144 plaques. Ce taux d'expansion peut être réalisé en deux occasions séparées. Un technicien nécessite environ 3,5 minutes pour nourrir une plaque de 6 puits alors qu'ils dépensent environ 30 secondes avec une plaque de 96 puits pour l'examiner sur le microscope et le placer sur le robot. Si le technicien est en train 144 plaques, ils vont passer environ 1,2 plaques de manutention hr lorsque l'alimentation avec le robot alors que la culture manuelle nécessitera un 8 h dédié à nourrir. S'il vous plaît cliquez ici pour vIEW une version plus grande de cette figure.