Isolement et cryoconservation des rats nouveau-nés cardiomyocytes
Summary
The isolation of neonatal rat cardiomyocytes is a time consuming and unpredictable procedure. This study describes methods for cryopreservation and thawing of neonatal rat cardiomyocytes that allows for more efficient use of cells. The thawed NRCMs can be used for various experiments without the need for performing isolations each time.
Abstract
Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is difficult and time consuming. The most commonly used cells are neonatal rat cardiomyocytes (NRCMs), which require isolation every time cells are needed. The birth of the rats can be unpredictable. Cryopreservation is proposed to allow for cells to be stored until needed, yet freezing/thawing methods for primary cardiomyocytes are challenging due to the sensitivity of the cells. Using the proper cryoprotectant, dimethyl sulfoxide (DMSO), cryopreservation was achieved. By slowly extracting the DMSO while thawing the cells, cultures were obtained with viable NRCMs. NRCM phenotype was verified using immunocytochemistry staining for α-sarcomeric actinin. In addition, cells also showed spontaneous contraction after several days in culture. Cell viability after thawing was acceptable at 40-60%. In spite of this, the methods outlined allow one to easily cryopreserve and thaw NRCMs. This gives researchers a greater amount of flexibility in planning experiments as well as reducing the use of animals.
Introduction
La culture cellulaire de cardiomyocytes est un outil essentiel dans la recherche cardiaque moderne. Cardiomyocytes de rats nouveau-nés (NRCMS) sont couramment utilisés depuis l'isolement et de la culture est plus facile que celle de cardiomyocytes de rats adultes 1. Procédé CNRM a encore plusieurs limites, notamment une procédure d'isolement de long et la prolifération cellulaire limitée dans le plat. Il existe de nombreux protocoles pour l'isolement de NRCMS avec nécessitant le plus généralement 4-48 heures de travail 2-6. En outre, les cellules sont souvent isolées à partir de ratons de 1 jour à 2 vieux rats 2,4-7; le moment de la naissance peut être imprévisible et les conflits avec d'autres travaux dans le laboratoire. Les isolats peuvent être inefficace et inutile si seulement une petite quantité de cellules sont nécessaires pour les expériences. La plupart des efforts sur l'amélioration de la mise au point de flux de travail sur la réduction du temps de l'isolement, mais cela ne résout pas les problèmes de synchronisation la naissance des chiots.
Comme alternatives, de nombreux laboratoires utilisentcardiomyocytes dérivés de cellules souches embryonnaires (CSE) ou des cellules souches pluripotentes induites (CISP). Cependant, le processus de reprogrammation et / ou la différenciation peut être très long et coûteux aussi bien. Il peut y avoir d'autres problèmes lors de l'utilisation de ces cellules comme des modèles in vitro des myocytes. Les deux cardiomyocytes dérivés ESC- et iPSC- ont été montré pour présenter des différences en électrophysiologie de cardiomyocytes primaires 8-10.
NRCMS dissociées sont capables d'être stockés pendant plusieurs jours en utilisant la réfrigération 11, mais cela ne permettent le stockage à long terme. L'azote liquide est typiquement utilisé pour maintenir les cellules à une plus grande période de temps, mais nécessite un cryoprotecteur tel que le diméthylsulfoxyde (DMSO). Des recherches antérieures ont montré que la concentration idéale entre 5-10% de DMSO dans les médias congélation permet pour la cryoconservation des NRCMS, mais même alors, la viabilité reste faible 12. Bien que le DMSO permet de protéger les cellules pendant gratuitementzing, il peut être toxique pour les cellules à des concentrations supérieures à 1,5% 13. Des études antérieures ont montré que la suppression de DMSO lentement à partir des cellules, peut améliorer la viabilité des cellules 14.
Nous avons cherché à améliorer l'efficacité du CNRM tests cellulaires par la cryoconservation des cellules après isolement. Ceci permet aux cellules d'être décongelés et utilisés lorsque cela est nécessaire, ce qui réduit la fréquence des isolements et de la consommation des animaux. En utilisant cette méthode, on montre qu'il est possible de cryoconservation et décongélation NRCMS pour une utilisation à un moment ultérieur. Après décongélation, les cellules conservent une viabilité acceptable et produisent des cultures CNRM qui sont positifs pour les α-actinine sarcomère (α-SA) et de se contracter spontanément.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole permet de les NRCMS à être isolées, cryoconservées et décongelées. Décongélation des cellules est une partie cruciale de la procédure. Une série de dilutions de DMSO est utilisé pour éliminer le DMSO lentement à partir des cellules 14. Il est important que l'extraction de DMSO être effectuée rapidement que les cellules sont particulièrement sensibles à la mort immédiatement après la décongélation. Si des cellules plus ou moins sont nécessaires pour la décongélation, le…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by funding from American Heart Association 12BGIA12040477, NC State University Chancellor’s Faculty Excellence Program, and National Natural Science Foundation of China H020381370216.
Materials
| IMDM (+25mM HEPES +L-glutamine) | Gibco | 12440-046 | With added 25mM HEPES and L-glutamine |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| HBSS (+Ca +Mg) | Corning | 21-020-CV | With added calcium and magnesium, pH 7.1-7.4 |
| Trypsin 0.25% | Gibco | 25300-056 | |
| Trypsin 0.05% | Gibco | 25300-054 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | Freezing media |
| Cryogenic Vial | Corning | 430659 | |
| Collagenase | Sigma | C1889-50MG | |
| 40μm Cell Strainer | Greiner Bio-One | 542040 | |
| Sterilizing Vacuum Filter (0.22μm) | Corning | 431118 | |
| 50mL Conical | Corning | 430828 | |
| 15mL Conical | Corning | 430790 | |
| trypan blue | Cellgro | 25-900-CI | |
| Mr Frosty Freezing Container | ThermoScientific | 5100-0001 | |
| Millicell EZ SLIDES | Millipore | PEZGS0416 | |
| α-sarcomeric actinin antibody | Sigma | A7811 | |
| Fibronectin | Corning | 356008 | |
| Bromodeoxyuridine | BD Biosciences | 51-7581KZ |
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